高小博 王譯晗 朱海英 張 辰 馬 旭 陸彩玲?

1.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心(北京,100081);2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院

先天性心臟病是我國排名首位的出生缺陷類型,占所有新生兒的8‰～10‰。[1]。先天性心臟病是造成心肌肥厚的重要因素之一[2]。目前已經(jīng)鑒定許多調(diào)控心肌肥厚的信號通路,包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)和蛋白激酶B(AKT)信號通路等[3-4]。Wnt信號在調(diào)控細胞命運以及隨后的細胞行為中扮演重要作用,蓬亂蛋白(Dvl)是高度保守的Wnt信號家族的關(guān)鍵成員,在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)3種Dvl蛋白Dvl1,Dvl2,Dvl3[5-8]。Malekar等[9]報道心臟特異性過表達Dvl1的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟體重比增大,左心室擴張,心肌細胞面積增大,出現(xiàn)明顯的心肌肥厚表型。Dvl2敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠有著嚴(yán)重的心血管流出道畸形,包括右心室雙出口,大動脈轉(zhuǎn)位和永存動脈干等[10]。然而,Dvl2在心肌肥厚中的作用尚未報道,在此本文研究了Dvl2基因?qū)ρ芫o張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)心肌細胞肥大的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與設(shè)備

抗體:Anti-Flag,Anti-α-actinin,Anti-β-actin,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,2μg/ml),TRITC標(biāo)記的抗小鼠Ig G熒光二抗購自sig ma公司;Antiβ-MHC購自Santa Cr uz公司;Anti-Phospho-p44/42 ERK1/2(Thr202/Tyr204),Anti-p44/42 ERK1/2,Anti-Phospho-AKT(Ser473),Anti-AKT,Anti-Dvl2購自Cell Signaling公司;辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔Ig G和山羊抗小鼠Ig G購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。重組腺病毒Ad-GFP和攜帶有Flag標(biāo)簽的Ad-Dvl2病毒購于山東維真生物科技有限公司。高效組織細胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(Ther mo公司),增強化學(xué)發(fā)光(ECL)液(Millipore公司),DMEM/F12液體培養(yǎng)基(Hycl one公司),胎牛血清(Hyclone公司),胰酶細胞消化液(Beyoti me公司),5-溴脫氧尿嘧啶(5-Br du,Sig ma公司),血管緊張素Ⅱ(AngⅡ,Sig ma公司),CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(美國For ma公司),激光共聚焦顯微鏡(Zeiss,LSM 710),全自動酶標(biāo)儀(Bio Tek,Gen5)。

1.2 原代心肌細胞培養(yǎng)

出生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠,經(jīng)75%酒精消毒后迅速取出心臟,剪取心尖部心室組織,置于預(yù)冷的Hanks液中,洗凈后將心臟剪成約1 mm3的碎塊,加入消化酶3 ml,37℃消化2～3 min后,吸取上清至含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中終止消化。重復(fù)上述消化步驟至組織塊基本透明狀。將收集的細胞過120目細胞篩,1000 rp m離心15 min,棄上清。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞,37℃差速貼壁,2 h后收集上清液,1000 rp m離心10 min,棄上清,用含0.1 mmol/L 5-Brdu,10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞后按所需密度接種于培養(yǎng)板,置于37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 細胞免疫熒光染色

將原代心肌細胞接種于鋪有玻片的24孔板中,用重組腺病毒Ad-GFP和Ad-Dvl2分別感染細胞24 h,隨后用生理鹽水和AngⅡ分別處理細胞48 h。棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌細胞2-3次,4%多聚甲醛室溫固定0.5 h,0.5%Triton X-100(PBS稀釋)透化10 min,5%BSA(PBS稀釋)封閉1 h;1:200稀釋的α-輔肌動蛋白(α-actinin)抗體,37℃孵育1 h或4℃過夜,PBS充分洗滌細胞;TRITC標(biāo)記的抗小鼠Ig G熒光二抗(1:100)和DAPI(1:1000)于37℃孵育1 h,充分洗滌后置于載玻片,抗熒光猝滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照記錄,每組取約200個心肌細胞利用軟件統(tǒng)計面積。

1.4 Wester n Bl ot檢測方法

將原代心肌細胞接種到6孔板中,經(jīng)處理后,收集細胞加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min,13000 r p m離心15 min,收集細胞上清。利用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度定量,12%SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用5%的脫脂牛奶封閉1 h后,分別用一抗4℃孵育過夜,TBST漂洗,隨后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,TBST漂洗后,ECL化學(xué)顯影。實驗中用β-actin作為內(nèi)參基因,利用I mage J軟件進行灰度定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Pris m 5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,組間比較采用t-檢驗,p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ上調(diào)Dvl2的表達

用1μM AngⅡ處理大鼠原代心肌細胞48 h后,收集細胞樣品進行Wester n Blot檢測。與對照組相比,AngⅡ處理引起Dvl2的表達顯著上調(diào)(圖1 A),Dvl2蛋白水平約為對照組的2倍(圖1 B)(p＜0.001)。

圖1 AngⅡ處理后心肌細胞Dvl2的表達情況

2.2 Dvl2過表達對心肌細胞影響

為了探究Dvl2對心肌細胞肥大的影響,我們用重組腺病毒Ad-GFP和Ad-Dvl2分別感染原代心肌細胞,用Flag抗體進行 Wester n檢測,結(jié)果顯示Ad-GFP感染組未檢測到陽性信號,而Ad-Dvl2感染組顯著過表達Dvl2(圖2C)。用Ad-GFP和Ad-Dvl2分別感染原代心肌細胞后進行AngⅡ處理,隨后進行α-actinin免疫熒光染色并測量心肌細胞面積。結(jié)果如圖2 A和2B所示,與生理鹽水組相比,Ad-GFP感染組經(jīng)AngⅡ處理后心肌細胞面積顯著增大(p＜0.001)。與Ad-GFP對照組相比,Ad-Dvl2感染組顯著增加了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大(p＜0.001)。Wester n檢測結(jié)果顯示,與生理鹽水處理組相比,AngⅡ處理后心肌細胞β-MHC的表達上調(diào)。與Ad-GFP感染組相比,Dvl2過表達促進了AngⅡ誘導(dǎo)的β-MHC表達的上調(diào)(圖2C)。

2.3 Dvl2對AKT通路的影響

為了探究Dvl2促進AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥大的可能機制,我們檢測了AKT和ERK1/2總蛋白和磷酸化水平。結(jié)果顯示Ad-GFP感染組經(jīng)AngⅡ處理后,與生理鹽水組相比,AKT和ERK1/2磷酸化水平顯著升高(圖3A)(p＜0.001);Ad-Dvl2感染組與Ad-GFP對照組相比,AKT磷酸化水平顯著升高(圖3 A和3B),而ERK1/2的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化(圖3C)。

圖2 Dvl2過表達對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞面積以及β-MHC表達的影響

圖3 細胞AKT和ERK1/2總蛋白及磷酸化水平檢測

3 討論

Dvl家族是高度保守的Wnt信號家族的關(guān)鍵成員,Dvl1與Dvl2同屬于Dvl蛋白家族。Wnt信號通路的異常激活與心肌肥厚、心衰、心律失常以及先天性心臟病等多種心臟疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系[11-13]。Malekar等[9]研究發(fā)現(xiàn)心臟特異性過表達Dvl1轉(zhuǎn)基因小鼠較野生型小鼠心臟明顯肥大,心功能指數(shù)降低。Van等[14]報道顯示敲除Dvl1能夠抑制主動脈弓縮窄(TAC)引起的小鼠心臟體重比以及心肌細胞橫截面積的增加,肥大指標(biāo)心房利鈉因子(ANF)和腦鈉肽(BNP)水平的升高。本研究發(fā)現(xiàn),大鼠原代心肌細胞經(jīng)AngⅡ處理后,Dvl2表達上調(diào),Dvl2過表達顯著增強AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞面積增大和肥大標(biāo)志物β-MHC的表達增加,這些體外研究表明Dvl2能夠促進AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大。

AKT和ERK1/2信號通路對心肌肥厚具有重要的調(diào)控作用。Hingtgen等[15]報道顯示AngⅡ通過作用于AT(1)受體,以時間依賴性的方式激活A(yù)KT信號通路,利用顯性負效應(yīng)的AKT預(yù)處理心肌細胞能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大。ERK1/2是MAPK信號通路的重要組成部分,Bueno等[16]報道顯示小鼠心臟特異性過表達 MAPK激酶MEK1后,ERK1/2通路被激活,心肌細胞面積增大,肥大相關(guān)指標(biāo)ANF、BNP和β-MHC水平升高,而ERK1/2通路抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)MEK1引起的心肌肥厚。本研究結(jié)果顯示Dvl2過表達顯著增加了AKT的磷酸化水平,而ERK1/2的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化,提示Dvl2可能通過作用于AKT信號通路促進心肌細胞肥大。

Wnt信號分為經(jīng)典的β-catenin依賴通路和非經(jīng)典不依賴β-catenin通路兩類。在經(jīng)典的Wnt信號通路中,Dvl激活并被招募至細胞質(zhì)膜上,抑制GSK-3β的活性,引起β-catenin復(fù)合物的解聚,導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi),隨后激活基因表達。GSK-3β是心肌細胞肥大的負性調(diào)節(jié)因子[17-19]。研究報道有活性的GSK-3β可與APC,axin等蛋白形成復(fù)合體,在轉(zhuǎn)錄水平抑制肥大相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NFAT,GATA4,c-Myc的表達,從而抑制心肌肥厚[20-23]。另有文獻報道顯示,GSK-3β是AKT下游靶基因之一,AKT能夠直接磷酸化GSK-3β,抑制其活性,從而促進心肌肥厚[24]。Van等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)Dvl1敲除能夠逆轉(zhuǎn)TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚,其機制可能與GSK-3β和AKT活性的改變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),Dvl2過表達能夠促進AngⅡ誘導(dǎo)的AKT信號通路的激活。提示Dvl2可能通過Wnt或AKT通路抑制GSK3β的活性調(diào)控心肌細胞肥大,具體的分子機制有待進一步的研究。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ處理引起心肌細胞Dvl2的表達升高,Dvl2過表達引起AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞面積和β-MHC表達的增加以及AKT信號通路的激活,表明Dvl2參與調(diào)控心肌細胞肥大,其作用機制可能與AKT信號通路相關(guān)。