倪冬冬 徐祥波 賀 斌 王藹明

1.第二軍醫(yī)大學(xué)(上海,200433);2.海軍總醫(yī)院;3.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所

目前在臨床上子宮內(nèi)膜的機(jī)械性損傷是導(dǎo)致宮腔粘連的主要原因,常見為月經(jīng)異常和繼發(fā)性不孕[1]。隨著宮腔鏡技術(shù)的應(yīng)用及宮腔內(nèi)手術(shù)操作的增加,宮腔粘連的發(fā)病率和診斷率顯著上升[2-3],宮腔粘連的本質(zhì)是子宮內(nèi)膜損傷后導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜纖維化[4]。目前研究已發(fā)現(xiàn)多種與子宮內(nèi)膜纖維化發(fā)生相關(guān)的因素,但子宮內(nèi)膜纖維化的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[5]。因此研究子宮內(nèi)膜損傷后的修復(fù)機(jī)制將為宮腔粘連的治療方法研究提供理論依據(jù)。有研究表明,組織器官在損傷后的修復(fù)過程中會激活胚胎時期與組織器官發(fā)生發(fā)育相關(guān)的信號通路[4]。通過激活這些信號通路,實現(xiàn)組織器官細(xì)胞增殖修復(fù)組織結(jié)構(gòu)以恢復(fù)其功能。Hedgehog(Hh)信號通路是胚胎時期的重要信號通路之一,該信號通路的激活能夠促進(jìn)多種組織的損傷修復(fù),如皮膚[6]、心肌[7]、骨骼肌[8]以及肝臟的損傷后修復(fù)[9]等。本文對Hh信號通路在子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)過程中的作用進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源

8周齡雌性Wistar大鼠(北京維通利華實驗動物有限公司)24只,體重180g～220g,數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組(6只)及實驗組(18只)。大鼠飼養(yǎng)于國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所實驗動物中心,均自由進(jìn)食正常飼料。大鼠實驗操作均遵守國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.2 模型建立及子宮標(biāo)本取材

①實驗組:將18只大鼠用2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉后行刮宮手術(shù)。分別取雙側(cè)子宮,在子宮角近卵巢約5 mm處剪開一小口,用自制刮勺探入宮腔反復(fù)搔刮子宮,至刮出子宮內(nèi)膜碎屑宮腔面粗糙后,縫合子宮,逐層縫合關(guān)閉大鼠背部切口。分別于搔刮后24h、72h、7d各取6只大鼠用0.2%苯巴比妥麻醉后切除雙側(cè)子宮。②正常組:6只大鼠不進(jìn)行任何干預(yù),在實驗組同等條件下飼養(yǎng),實驗第7天時麻醉后取雙側(cè)子宮。兩組大鼠雙側(cè)子宮取出后,一側(cè)子宮用4%多聚甲醛固定3天后用于蘇木精-伊紅(HE)染色、Msson染色和免疫組織化學(xué)染色;另一側(cè)子宮經(jīng)液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存供實時熒光定量PCR實驗,檢測大鼠子宮內(nèi)膜組織中Shh、Smo、Ptch1、Gli1的 mRNA表達(dá)水平。取材完成后大鼠斷頸處死。

1.3 HE染色

取4%多聚甲醛固定的兩組大鼠子宮中段組織石蠟包埋,5μm連續(xù)切片,切片常規(guī)脫蠟、水化,蘇木素染液中浸染5 min后用清水去多余染液,用1%鹽酸酒精將組織切片分化30s,流水沖洗返藍(lán),放入伊紅染液中浸染20～30s,清水洗去多余伊紅染液,將組織切片常規(guī)梯度脫水、透明,最后用中性樹膠封片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

取4%多聚甲醛固定的兩組大鼠子宮中段組織石蠟包埋、組織切片后經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后放入檸檬酸緩沖液(p H 6.0)中,加熱至95～98℃、20 min進(jìn)行抗原修復(fù)。取出切片冷卻至室溫,蒸餾水浸洗5 min后撈出切片,滴加3%H2O2后放入濕盒內(nèi)室溫孵育10 min,磷酸緩沖液(PBS)浸洗3次放入濕盒中,表面滴加5% 山羊血清,在37℃封閉30 min。棄去非免疫源性山羊血清,將稀釋好的一抗(稀釋倍數(shù)分別為:Smo 1:400、Shh 1:600、Ptch1 1:400、Gli1 1:500)滴加于組織切片上后放置于濕盒內(nèi),4℃過夜。次日取出切片PBS浸洗5 min 3次。將二抗滴加于織切片上放入濕盒中37℃孵育30 min后用PBS浸洗5 min 3次,最后進(jìn)行DAB顯色。經(jīng)過充分水洗后將組織切片放入蘇木精染色液中浸泡2 min,洗去殘留的染色液后1%鹽酸酒精分化2～3s后,1%氨水返藍(lán)3～4s,梯度酒精脫水,經(jīng)二甲苯透明后用中性樹膠封片。Smo、Ptch1及Gli1抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,Shh抗體購自博士德生物工程有限公司。

1.5 Masson染色

取4%多聚甲醛固定好的兩組大鼠子宮中段組織石蠟包埋、組織切片后常規(guī)脫蠟至水,用Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min,酸性乙醇分化液分化5～15s,水洗后Masson藍(lán)化液返藍(lán)3～5 min,蒸餾水洗1 min;麗春紅品紅染色液染色5～10 min,用弱酸工作液洗1 min,磷鉬酸溶液洗1～2 min后再用弱酸工作液洗1 min;放入苯胺藍(lán)染色液中染色1～2 min后弱酸工作液洗1 min,95%乙醇快速脫水,無水乙醇脫水3次,每次5～10s,最后用二甲苯透明3次,每次1～2 min,中性樹膠封片。

1.6 實時熒光定量PCR反應(yīng)

提取總RNA測定濃度后反轉(zhuǎn)錄成c DNA并作為模板,加入相應(yīng)上下游引物及SYBR Pre mix Ex TaqTMII進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL,反應(yīng)條件:95℃孵育30s,95℃變性10s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共40個循環(huán)。以GAPDH為參照,每個樣品每種引物重復(fù)3個孔,基因表達(dá)的相對變化采用2-△△Ct方法處理分析。序列見表1。

表1 各蛋白引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以ˉx±s表示,統(tǒng)計方法采用獨立樣本的t檢驗和單因素方差分析,以p＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及Masson染色

HE染色結(jié)果,子宮內(nèi)膜機(jī)械損傷后24h,大鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)破壞,子宮內(nèi)膜上皮缺失,腺體減少;72h大鼠子宮腔結(jié)構(gòu)未完全恢復(fù),子宮腔被薄層內(nèi)膜上皮覆蓋;7d大鼠子宮內(nèi)膜較72h稍增厚,腺體明顯減少,子宮腔形態(tài)差,子宮內(nèi)膜仍較正常內(nèi)膜薄。Masson染色結(jié)果,子宮內(nèi)膜機(jī)械性損傷后7d的大鼠子宮內(nèi)膜藍(lán)染程度明顯較正常組增強(qiáng),膠原纖維明顯增加(圖1、圖2)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色

顯微鏡下顯示Shh、Smo、Ptch1及Gli1染色呈棕黃色顆粒,主要位于子宮腺體及內(nèi)膜組織。Shh在正常組及子宮機(jī)械損傷后各時間點均未表達(dá);Smo在正常組有表達(dá),但在實驗組24h表達(dá)很弱,72h后表達(dá)逐漸增強(qiáng);Ptch1在正常組及實驗組24h均有弱表達(dá),72h后表達(dá)量明顯上升;Gli1在正常組與實驗組24h表達(dá)無差異,72h及7d表達(dá)量明顯增加。(圖3)。

圖1 正常組和實驗組大鼠子宮內(nèi)膜HE染色(×100)

圖2 正常組和實驗組7d大鼠子宮內(nèi)膜Masson染色(×100)

圖3 正常組及實驗組大鼠子宮內(nèi)膜Shh,Smo,Ptch1及Gli1免疫組化染色(×100)

2.3 實時定量PCR檢測

Shh mRNA在兩組均未見表達(dá)。Smo mRNA在實驗組24h的表達(dá)量是正常組的0.7倍,72h的表達(dá)量是正常組的1.4倍,7d的表達(dá)量是正常組的1.5倍(均p＜0.05);Ptch1 mRNA在實驗組24h的表達(dá)量是正常組的1.2倍(P＞0.05),72h的表達(dá)量是正常組的3.3倍(p＜0.01),7d的表達(dá)量是正常組的2.5倍(p＜0.05);Gli1 mRNA在實驗組24h的表達(dá)量是正常組的1.6倍(p＜0.05),72h的表達(dá)量是正常組的9.3倍(p＜0.01),7d的表達(dá)量是正常組的5.7倍(p＜0.01)。實驗組72h Ptch1和Gli1的mRNA的表達(dá)量均高于24h的表達(dá)量,且72h Gli1的mRNA表達(dá)量高于7d的表達(dá)量(p＜0.01)。見圖4。

圖4 兩組大鼠子宮Ptch1、Gli1、Shh、Smo mRNA表達(dá)水平

3 討論

子宮內(nèi)膜基底層損傷是導(dǎo)致宮腔粘連的主要原因,易發(fā)生于妊娠期的宮腔手術(shù)治療后[10]。宮腔粘連可導(dǎo)致不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、月經(jīng)異常及腹痛等癥狀[11]。因此,預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜損傷后導(dǎo)致的纖維化就顯得尤為重要,但目前子宮內(nèi)膜纖維化機(jī)制尚不清楚,本文對Hh信號通路與子宮內(nèi)膜損傷后的纖維化之間的關(guān)系進(jìn)行了初步探索。

Hh途徑是動物體內(nèi)存在的重要信號途徑,參與胚胎發(fā)育、毛發(fā)周期和多種腫瘤的發(fā)生[12-15]。主要由Hedgehog配體(hh)、2個膜受體Ptch、Smo及下游的轉(zhuǎn)錄因子 Gli組成[16]。在脊椎動物中,Hh有3個同源基因Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)、Desert hedgehog(Dhh),這3個基因可編碼相應(yīng)的分泌蛋白—Hh配體。Smo和Gli1是HH途徑的2個重要分子;Smo蛋白是信息轉(zhuǎn)換器,它能夠?qū)⒓?xì)胞外的SHH信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Gli1信號。Hh信號通路途徑在正常情況下,Ptch抑制Smo蛋白活性,從而抑制下游通路,這時Hh信號處于抑制狀態(tài)。當(dāng)Ptch與Hh結(jié)合后,解除了Ptch對Smo的抑制作用,Smo將信號傳遞給由驅(qū)動蛋白Cos2和Fu組成的蛋白復(fù)合體,使Gli家族成員中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子(Ci)轉(zhuǎn)移至核內(nèi),激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄[17]。

有研究表明,Hh信號通路參與多個組織器官損傷后的纖維化修復(fù)過程[17]。在成人肝臟損傷后重建時H H信號通路可以被激活,修復(fù)過程中Shh和Ihh表達(dá)明顯增加[18-19]。其激活的機(jī)制可能是肝損傷后各種生長因子誘導(dǎo)肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(HSC)表達(dá)Shh和Ihh或者肝臟上皮細(xì)胞通過旁分泌機(jī)制激活臨近基質(zhì)細(xì)胞的Hh信號[20-21]。Pritchett等[22]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)給予肝纖維化的小鼠模型使用Smo阻斷劑時,Gli1、Gli2、Gli3表達(dá)量均下降,標(biāo)志肝纖維化程度的Ⅰ型膠原蛋白也下降。Fabian等[23]發(fā)現(xiàn)在慢性腎纖維化患者腎小管細(xì)胞中Shh、Ihh、Gli1、Gli2的表達(dá)量均增加。在小鼠腎纖維化模型中使用Hh拮抗劑阻斷此信號途徑時,上述分子表達(dá)量降低,同時小鼠腎臟纖維化程度降低,表明Hh信號通路在腎纖維化過程中有重要作用。

Gli1既是Hh信號通路的靶標(biāo)基因又是信號通路的轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)水平反應(yīng)了Hh信號通路的活性,也可反應(yīng)出組織器官纖維化的程度。Kramann等[24]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)給予小鼠Gli阻滯劑Darinaparsin時,Gli1、Gli2、FN、Col-1、α-SMA的表達(dá)均降低,同時腎纖維化程度也明顯降低。上述研究說明Gli信號通路在腎臟纖維化過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示,實驗組第7天的大鼠子宮內(nèi)膜纖維化較正常組明顯增加。且隨著大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度增加,實驗組72h Smo的mRNA表達(dá)量開始上升,而Gli1和Ptch1的mRNA則顯著上升。Ptch1、Gli1和Smo在子宮內(nèi)膜損傷后mRNA表達(dá)量的變化趨勢與子宮內(nèi)膜的纖維化之間存在相關(guān)性。本研究也顯示Shh在正常組及子宮機(jī)械損傷后每個時間點的大鼠子宮內(nèi)膜及腺體上均未見表達(dá),但Ptch1、Gli1和Smo的mRNA表達(dá)量都有不同程度上升,以Gli1上升最為顯著,說明Hh信號通路可能參與了大鼠子宮內(nèi)膜損傷后的纖維化修復(fù),但Shh基因未參與,而參與的可能是Shh的同源基因。同時除經(jīng)典Hh信號通路外,還存在其他的活化途徑,如轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等在沒有活化Smo的情況下使GLI轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[25]。Moshai等[26]研究表明,從Smo水平抑制Hh通路,對纖維化無影響,從Gli水平抑制纖維化效果顯著。此現(xiàn)象可能是由于Gli通過其他信號通路被活化所致,如FGF、EGF和MAPK通路。因此,Gli可能與多種纖維化相關(guān)信號通路有關(guān),抑制Gli的活性可能成為組織器官纖維化治療的靶標(biāo)[27]。本次研究也顯示子宮內(nèi)膜損傷后Gli1上升顯著而Shh幾乎不表達(dá),說明子宮內(nèi)膜損傷后的纖維化修復(fù)與Gli1的關(guān)系密切,大鼠子宮損傷后的纖維化修復(fù)過程中Gli1可能是通過非經(jīng)典Hh信號途徑發(fā)揮作用。

總之,本研究表明Ptch1、Gli1和Smo在損傷后大鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)變化與子宮內(nèi)膜損傷后纖維化修復(fù)過程相關(guān)。Hh通路參與了子宮內(nèi)膜損傷后的纖維化形成過程,但可能是通過Shh的同源基因或非經(jīng)典途徑參與子宮內(nèi)膜纖維化修復(fù),為進(jìn)一步闡明子宮內(nèi)膜損傷后的纖維化修復(fù)機(jī)制提供新視角。