周 偉，駱德偉

（1.杭州頂津食品有限公司，浙江杭州 310018；2.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南吉首 416000）

0 引言

桂花酒（Chinese rice wine） 是以糯米和金桂花等為主要原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、澄清、過(guò)濾、煎酒、貯藏和勾兌而成的釀造酒。它酒性醇和、營(yíng)養(yǎng)豐富，其含有的糖、肽、氨基酸等低分子浸出物和微量元素易被人體消化吸收，是深受人們喜愛(ài)的滋補(bǔ)酒、飲料酒和調(diào)味酒。但由于桂花酒的營(yíng)養(yǎng)成分特別豐富，酒體中含有較多的蛋白質(zhì)、多酚（單寧）、脂肪、焦糖色素和多糖等大分子成分，酒體貯存期間較易發(fā)生混濁、沉淀，傳統(tǒng)的棉餅、硅藻土或紙板過(guò)濾往往很難獲得理想的澄清效果[1-2]。因此，結(jié)合傳統(tǒng)工藝，利用木瓜蛋白酶和果膠酶復(fù)合酶法對(duì)酒體進(jìn)行澄清處理，以提高桂花酒的穩(wěn)定性及品質(zhì)[3-5]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

傳統(tǒng)手工桂花酒，3年陳釀，購(gòu)于湖南省懷化市洪江區(qū)；木瓜蛋白酶（酶活力50 000 U/g）、果膠酶（酶活力100 000 U/g），江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司提供；乙酸、碳酸氫鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S2型恒溫水浴鍋，金壇市成輝儀器廠產(chǎn)品；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司產(chǎn)品；OU-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；U/GZX-9070 MBE型鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；PHSJ-4A型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；5810R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品。

1.3 樣品檢測(cè)與工藝流程

1.3.1 桂花酒的酶處理澄清工藝流程

酶處理桂花酒的澄清工藝流程為：使用碳酸氫鈉溶液或乙酸對(duì)樣品桂花酒進(jìn)行pH值調(diào)試，加入相應(yīng)濃度的酶，在適當(dāng)溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，一段時(shí)間后使用臺(tái)式冷凍離心機(jī)以轉(zhuǎn)速6 500 r/min離心10 min，于波長(zhǎng)660 nm處的吸光度（吸光度即表示澄清度）[6]。

1.3.2 樣品pH值和吸光度檢測(cè)

檢測(cè)桂花酒pH值和吸光度（即于波長(zhǎng)660 nm處所測(cè)吸光度）。

1.3.3 木瓜蛋白酶的單因素試驗(yàn)

（1）酶添加量。將樣品酒調(diào)至pH值為4，酶添加量依次為0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，并在溫度50℃條件下3 h水浴處理后，測(cè)定其吸光度。

（2） pH值。取調(diào)節(jié)pH值后的桂花酒，木瓜蛋白酶酶解能力在偏酸性條件較強(qiáng)，因此pH值分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，在已確定酶添加量的基礎(chǔ)上，桂花酒在酶解溫度50℃，處理3 h后，測(cè)定其吸光度，確定pH值。

（3）酶處理溫度。改變木瓜蛋白酶處理的溫度40，45，50，55，60℃，在已確定的條件基礎(chǔ)上，酶反應(yīng)時(shí)間3 h，測(cè)定其吸光度。

（4）酶反應(yīng)時(shí)間。取前面的其他因素的最佳條件下進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)間1，2，3，4，5 h的確定。1.3.4 果膠酶的單因素試驗(yàn)[7]

（1） 酶添加量。將樣品桂花酒調(diào)至pH值為4，加入酶添加量依次為0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，在酶反應(yīng)溫度50℃，處理3 h后，測(cè)定其吸光度。

（2） pH值。取桂花酒相應(yīng)pH值（果膠酶的作用pH值為2.5～6.0），由于過(guò)酸性影響酒的口感和氣味，所以選擇pH值的范圍為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，在酶添加量確定的條件下，酶反應(yīng)溫度50℃，處理3 h后，測(cè)定其吸光度。

（3）酶處理溫度。改變果膠酶的處理溫度40，45，50，55，60℃，在酶添加量和pH值確定的條件下，反應(yīng)3 h后測(cè)定其吸光度。

（4） 酶反應(yīng)時(shí)間。取其他因素的最佳條件（酶添加量0.5%，反應(yīng)溫度40℃，pH值3） 改變酶反應(yīng)時(shí)間1，2，3，4，5 h，并測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶處理樣品酒的單因素的確定

2.1.1 酶添加量對(duì)澄清度的影響

木瓜蛋白酶添加量對(duì)澄清度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 木瓜蛋白酶添加量對(duì)澄清度的影響

由圖1可知，木瓜蛋白酶處理桂花酒樣品的澄清效果隨著酶添加量的增加而變化，樣品的澄清度在酶添加量為0.5%時(shí)達(dá)到最佳。由試驗(yàn)結(jié)果可得，在酶添加量比較小時(shí)，酶的處理達(dá)不到有效的效果，反而會(huì)使桂花酒更加渾濁；反之酶添加量過(guò)大，雖然有澄清效果，但是成本過(guò)高。綜合各方面的因素，同一條件下進(jìn)行木瓜蛋白酶的處理，因此選擇酶添加量0.5%左右。

2.1.2 桂花酒pH值對(duì)澄清度的影響

桂花酒pH值對(duì)木瓜蛋白酶澄清效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 桂花酒pH值對(duì)木瓜蛋白酶澄清效果的影響

由圖2可知，在相同條件下對(duì)桂花酒進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)，隨著pH值的不斷增加，酒體的澄清度也在不斷下降，在pH值為3時(shí)，桂花酒的澄清度最高。因此，在相同酶添加量時(shí)，pH值為3時(shí)澄清效果最佳。

2.1.3 酶處理溫度對(duì)澄清度的影響

木瓜蛋白酶處理溫度對(duì)澄清度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 木瓜蛋白酶處理溫度對(duì)澄清度的影響

由圖3可知，得到桂花酒的澄清度隨著處理溫度的不斷變化而發(fā)生波動(dòng)，酶處理溫度為40℃時(shí)，其澄清效果最佳。

2.1.4 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)澄清度的影響

木瓜蛋白酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)澄清度的影響見(jiàn)圖4。

在各條件達(dá)到最優(yōu)條件時(shí)，酶反應(yīng)4 h時(shí)桂花酒的澄清度達(dá)到最佳。因此，在單因素試驗(yàn)中所得最佳條件為酶添加量0.5%，pH值3，在酶處理溫度40℃條件下處理4 h時(shí)的澄清度為最佳。

圖4 木瓜蛋白酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)澄清度的影響

2.2 果膠酶處理樣品酒的單因素的確定

2.2.1 酶添加量對(duì)澄清度的影響

果膠酶酶添加量對(duì)澄清度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 果膠酶酶添加量對(duì)澄清度的影響

由圖5可知，樣品桂花酒的澄清度在不斷變化，澄清度在酶添加量為0.5%時(shí)達(dá)到最佳。由試驗(yàn)結(jié)果可得，在酶添加量比較小時(shí)，酶的處理達(dá)不到有效的效果，會(huì)使桂花酒渾濁；反之酶添加量過(guò)大，雖然有澄清效果，但是成本過(guò)高。綜合各方面的因素，選擇酶添加量為0.5%左右。

2.2.2 桂花酒pH值對(duì)澄清度的影響

桂花酒pH值對(duì)果膠酶澄清效果的影響見(jiàn)圖6。

圖6 桂花酒pH值對(duì)果膠酶澄清效果的影響

由圖6可知，調(diào)節(jié)樣品pH值在相同條件下對(duì)溶液進(jìn)行處理，隨著pH值的不斷增加，桂花酒的澄清度也在不斷下降，在pH值為4.5時(shí)，溶液的澄清度最高。因此，在pH值為4.5時(shí)，添加同等酶添加量對(duì)樣品的澄清效果最佳。

2.2.3 酶處理溫度對(duì)澄清度的影響

酶處理溫度對(duì)澄清度的影響見(jiàn)圖7。

圖7 酶處理溫度對(duì)澄清度的影響

經(jīng)過(guò)對(duì)酶處理溫度的單因素試驗(yàn)，得到酒體的澄清度隨著酶處理溫度的不斷變化而發(fā)生波動(dòng)，當(dāng)酶處理溫度為40℃時(shí)，桂花酒的澄清效果最佳。

2.2.4 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)澄清度的影響

果膠酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)澄清度的影響見(jiàn)圖8。

圖8 果膠酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)澄清度的影響

當(dāng)各條件為最優(yōu)條件時(shí)，樣品酒的澄清度反應(yīng)4 h時(shí)達(dá)到最佳。因此，在單因素試驗(yàn)中所得最佳條件為酶添加量0.5%，pH值4.5，在酶處理溫度40℃條件下反應(yīng)4 h時(shí)的澄清度為最佳。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在木瓜蛋白酶處理樣品酒的單因素試驗(yàn)中得出，最佳的條件為酶添加量0.5%，酶處理溫度40℃，酶反應(yīng)時(shí)間4 h，pH值3時(shí)，酒體的澄清效果最好；而果膠酶處理樣品酒的單因素試驗(yàn)中得出，最佳的條件為酶添加量0.5%，酶處理溫度40℃，酶反應(yīng)時(shí)間4 h，pH值4.5時(shí)，酒體的澄清效果最好。因此，木瓜蛋白酶和果膠酶處理樣品酒的正交試驗(yàn)表中各因素確定為在單因素試驗(yàn)中得到的最佳條件為參照值，成為1個(gè)五因素四水平的正交表。

不同因素作用下的澄清度正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，不同因素作用下的澄清度正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 復(fù)合酶澄清工藝的優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)影響因素的R大小排列為E＞B＞D＞C＞A，由此可見(jiàn)，極差R越大對(duì)試驗(yàn)效果的影響越大，即對(duì)桂花酒的澄清度的影響越大，即pH值＞酶處理溫度＞酶反應(yīng)時(shí)間＞酶添加量＞酶量比。最佳的試驗(yàn)方案為A2B4C1D1E4，即最佳的復(fù)合酶澄清傳統(tǒng)手工桂花酒的工藝條件為酶處理溫度50℃，pH值4.5，酶添加量0.1%，酶反應(yīng)時(shí)間1 h，酶量比1∶2。在此最佳條件下的澄清度為0.015，在原酒的條件上提高了28.6%。

表1 不同因素作用下的澄清度正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 不同因素作用下的澄清度正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)木瓜蛋白酶4個(gè)影響因素的單因素試驗(yàn)結(jié)果為酶添加量0.5%，酶處理溫度40℃，酶反應(yīng)時(shí)間4 h，pH值3時(shí)，澄清度最低，澄清效果最好；果膠酶的單因素試驗(yàn)中得到酶添加量0.5%，酶處理溫度40℃，酶反應(yīng)時(shí)間4 h，pH值4.5時(shí)澄清效果最好。影響復(fù)合酶處理和澄清桂花酒5個(gè)因素影響的正交試驗(yàn)結(jié)果為pH值＞酶處理溫度＞酶反應(yīng)時(shí)間＞酶添加量＞酶量比，即最佳提取工藝條件為酶處理溫度50℃，pH值4.5，酶添加量0.1%，酶反應(yīng)時(shí)間1 h，酶量比1∶2，此時(shí)桂花酒的澄清度提高了28.6%。