秦豐偉 黃荷 焦鋒 唐望

1廣州市中西醫(yī)結合醫(yī)院骨科（廣州 510800）；2廣州中醫(yī)藥大學（廣州 510405）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）在50歲以上的人群中有著很高的發(fā)病率，是一種常見的骨科疾病，因其發(fā)病機制復雜，仍然沒有確切的治療方法，亦成為科研工作者的研究熱點。研究表明，IL-1、TNF-α、MMP-3、IL-10與骨關節(jié)炎的病理變化關系密切，因此，如何改善上述因子的表達水平是治療骨關節(jié)炎的關鍵。骨髓間充質干細胞（BMSCs）擁有強大的自我更新、增殖能力及分化潛能，具有免疫抑制和抗炎作用［1]，近年來作為理想的種子細胞治療骨關節(jié)炎已成為研究焦點。BMSCs可能是依靠其抗炎、抗免疫等生物特性干預修復損傷的軟骨組織，但是大量基礎和臨床實驗發(fā)現(xiàn)BMSCs移植到目標區(qū)域后，受損的軟骨并沒有得到有效的修復，這也成為BMSCs移植治療骨關節(jié)炎的一大難點。那么如何提高BMSCs的活性進而促進其向成軟骨及成骨細胞增殖分化就成為研究的關鍵。在諸多的補腎中藥中，淫羊藿是治療骨性關節(jié)炎的常用中藥，也是目前研究最多的一種。研究表明淫羊藿苷作為淫羊藿的主要有效成份，能促進成骨細胞的增殖與分化，促進機體產生促成骨細胞生長的因子而促進成骨細胞的增殖與分化，還能抑制破骨細胞［2-3]。因此，淫羊藿苷很有可能可以提高BMSCs活性，增強其修復軟骨能力。為此，本實驗通過研究淫羊藿苷對BMSCs活性的影響以及兩者的共育液關節(jié)腔注射對兔骨關節(jié)炎模型關節(jié)液中IL-1、TNF-α、MMP-3、IL-10表達的影響，為后期BMSCs治療骨關節(jié)炎提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物普通級健康新西蘭雄兔1只，3月齡，2～3 kg，由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，用于骨髓間充質干細胞分離、培養(yǎng)等。

1.1.2 主要試劑及實驗器材兔骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基（Cyagen公司，RBXMX-90011）、淫羊藿苷（Sigma公司，I1286）、含0.25%EDTA的胰酶（Cyagen公司，TEDTA-10001-100）、戊巴比妥鈉（美國Gibco公司，69020100）、CCK-8（日本同仁公司）、transwell小室（Corning公司）等。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs培養(yǎng)3%的戊巴比妥鈉按1 mL/kg經耳緣靜脈注射行兔全身麻醉，無菌條件下，于一側股骨下端行骨髓穿刺，接無菌針管（內含肝素）抽取骨髓4 mL，隨即將骨髓移入抗凝管抗凝，將骨髓移入超凈工作臺，加入兔骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基，吹打混勻，接種于25 cm2培養(yǎng)皿，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次半量更換培養(yǎng)液，此后依據(jù)細胞生長情況2～3 d半換液1次。7～8 d后，倒置顯微鏡下觀察細胞可達到達80%融合后，進行傳代培養(yǎng)：加入含有0.25%EDTA的胰蛋白酶消化1 min。通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)貼壁細胞間隙增大時，加入等量專用培養(yǎng)基終止消化，吹打瓶壁細胞使其脫壁。多數(shù)細胞脫離瓶壁形成細胞懸液后，按照1∶2重新接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 BMSCs成骨和成軟骨誘導取第3代BMSCs，以1×105/孔密度接種于6孔板，每孔加2 mL基礎培養(yǎng)基，飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細胞爬滿匯合后，培養(yǎng)基分別換成成軟骨誘導培養(yǎng)基和成骨誘導培養(yǎng)基。每隔2 d換液，每日觀察細胞生長情況。3周后分別采用阿爾新藍染色和ALP染色和茜素紅染色。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活性取第3代BMSCs，以5×103的密度接種于96孔板，共6塊，每塊板6個組，各有5個復孔，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h細胞貼壁后，加入不同濃度的ICA進行干預，分為 0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L ICA組，各組分別干預 12、24、36、48、72、96 h后，每孔加入10μL CCK-8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育40 min，于酶標儀波長450 nm處檢測各組細胞吸光度值。

1.2.4 動物分組及骨關節(jié)炎模型的建立將20只兔隨機分為空白組、模型組、BMSCs組、BMSCs+ICA組，各5只。模型組及治療組兔采用注射木瓜蛋白酶法造模，關節(jié)腔內注射4%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL，對照組注射等劑量的生理鹽水；每3天重復注射1次，共注射3次。首次注射4周后即可以獲得穩(wěn)定的膝骨關節(jié)炎模型。

1.2.5 BMSCs和ICA共育液關節(jié)腔注射及標本的收集按照前期實驗的結果，移植干細胞選擇第3代細胞。模型組關節(jié)腔內注射0.2 mL培養(yǎng)液；BMSCs組：常規(guī)細胞消化、離心得混懸液，調整細胞最終濃度為5×104/mL，取0.2 mL關節(jié)內注射；BMSCs+ICA組：淫羊藿苷與BMSCs共育液，細胞最終濃度為5×104/mL，取0.2 mL關節(jié)內注射。對照組和模型組關節(jié)腔注射等量生理鹽水。2周后分別抽取關節(jié)液0.5 mL，1 500 r/min離心后，-70℃保存。

1.2.6 觀測指標及測定關節(jié)液中IL-1、IL-10、TNF-α、MMP-3的含量使用ELISA法檢測。具體步驟按上海信帆生物科技有限公司提供的ELISA檢測試劑盒說明進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞的形態(tài)兔BMSCs第三代細胞傳代48 h，覆蓋率達90%以上（圖1a）。

2.2 BMSCs體外誘導成骨及成軟骨能力鑒定BMSCs在成軟骨誘導液培養(yǎng)下向軟骨細胞分化，14 d后，通過阿爾新藍染色發(fā)現(xiàn)，細胞質呈藍色，細胞分支染色略淡，可以辨認出細胞核的輪廓，見圖1。在成骨誘導液培養(yǎng)下，BMSCs向成骨細胞分化，細胞誘導2周后采用茜素紅染色顯示大量鈣結節(jié)形成，見圖1；ALP染色發(fā)現(xiàn)黑色顆粒，出現(xiàn)深藍色鈣化結節(jié)影，見圖1。體外誘導實驗說明BMSCs可以向成骨細胞及成軟骨細胞分化。

2.3 ICA對BMSCs活性的影響研究發(fā)現(xiàn)，0.01 μmol/L的ICA對BMSCs的活性無明顯影響，0.1、1、10μmol/L的ICA可提高BMSCs的活性，且各組作用的最佳時間都是72 h，其中1μmol/L的ICA對BMSCs活性的影響作用最明顯，與其他比較各組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而100μmol/L ICA對BMSCs活性具有抑制作用。如圖2所示。

注，圖a，第三代BMSCs形態(tài)（倒置相差顯微鏡（×100）；圖b，BMSCs成骨誘導14 d后茜素紅染色顯示鈣結節(jié)形成（倒置相差顯微鏡（×100）；圖c，BMSCs成骨誘導后ALP染色顯示深藍色鈣化結節(jié)影（倒置相差顯微鏡（×100）；圖d，BMSCs成軟骨誘導后阿爾新藍染色顯示細胞核輪廓可以辨認，細胞質呈現(xiàn)藍色（倒置相差顯微鏡（×100）

圖2 不同濃度的ICA干預不同時間對BMSCs細胞生物活性的影響Fig.2 Proliferation of BMSCs stimulated by ICA

2.4 治療前后關節(jié)液中IL-1、IL-10、TNF-α、MMP-3水平變化情況造模成功后，與空白組對比，其余各組關節(jié)液中IL-1、TNF-α、MMP-3均明顯升高，IL-10水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。關節(jié)腔注射2周后，與模型組相比，BMSCs和BMSCs+ICA組IL-1、TNF-α、MMP-3均下降，而IL-10升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且BMSCs+ICA組明顯優(yōu)于BMSCs組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組治療前后關節(jié)液中IL-1、IL-10、TNF-α、MMP-3水平變化無顯著性差異（P＞0.05）；見圖3及表1。上述結果證明，BMSCs關節(jié)腔內植入能夠抑制炎癥因子IL-1、TNF-α的產生，促進抗炎癥因子IL-10的產生，使軟骨降解產物MMP-3下降；而淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞的干預，可以在很大程度上提高其活性，更好的發(fā)揮其抑制炎癥因子、促進抗炎癥因子和減緩軟骨降解的作用。

圖3 各組治療前后關節(jié)液中IL-1、IL-10、TNF-α、MMP-3表達水平柱狀圖Fig.3 The levels of interleukin-1，interleukin-10，tumor necrosis factor-α，matrix metalloprotease-3 in the joint fluid of experimental group and control group before and after treatment

3 討論

3.1 IL-1、IL-10、TNF-α、MMP-3在骨關節(jié)炎病理過程中的作用骨關節(jié)炎的病理變化十分復雜，可能與多種細胞因子和軟骨蛋白降解酶有著密切的聯(lián)系。目前研究已經證實，IL-1和TNF-α可能是骨關節(jié)炎的始發(fā)因子。正常軟骨組織中IL-1含量極低，但在骨關節(jié)炎發(fā)病過程中IL-1含量明顯增高，IL-1可以誘導MMP-3的合成，MMP-3又可以促使軟骨基質中的蛋白多糖高度裂解，最終形成對關節(jié)軟骨的破壞［4]。在此病理過程中，TNF-α和IL-1具有高度協(xié)同作用，TNF-α可以促使IL-1的合成，而IL-1又可以誘導TNF-α的表達。兩者形成惡性循環(huán)，加重滑膜的炎癥反應和軟骨的降解。臨床研究也證實了骨關節(jié)炎患者血清和關節(jié)液中TNF-α水平明顯升高，且與關節(jié)炎輕重程度呈正相關關系［5]。與T細胞亞群之一的Th1分泌的IL-1、TNF-α等炎癥因子相反，其另一亞群Th2分泌的IL-10則能夠促進抗炎因子的釋放，經常被作為正向調節(jié)因子被應用于臨床和實驗研究［6-7]。

表1 各組治療前后關節(jié)液中IL-1、IL-10、TNF-α、MMP-3表達水平Tab.1 The levels of interleukin-1,interleukin-10,tumor necrosis factor-α,matrix metalloprotease-3 in the joint fluid of every group ± s，pg/mL

表1 各組治療前后關節(jié)液中IL-1、IL-10、TNF-α、MMP-3表達水平Tab.1 The levels of interleukin-1,interleukin-10,tumor necrosis factor-α,matrix metalloprotease-3 in the joint fluid of every group ± s，pg/mL

注：與模型組相比，*P＜ 0.05；與BMSCs組相比，▽P＜0.05

IL-1治療前治療后IL-10治療前治療后MMP-3治療前治療后TNF-α治療前治療后CT 6.58±0.95 7.02±1.12 82.92±4.23 83.04±3.25 4.37±1.48 4.65±1.96 16.13±2.11 15.72±1.78 Model 15.52±1.69 13.93±1.45 67.87±3.12 69.24±3.82 15.12±1.73 15.42±1.89 39.76±3.06 38.54±3.07 BMSCs 14.72±1.72 11.43±1.74*66.24±2.74 74.12±4.25*16.08±1.98 11.89±1.75*37.85±2.85 30.26±2.09*ICA+BMSCs 15.50±1.52 8.89±1.67*▽66.25±2.42 86.92±2.04*▽14.92±1.64 7.64±1.97*▽38.17±3.04 22.34±2.66*▽

3.2 關節(jié)腔內注射BMSCs治療骨關節(jié)炎BMSCs能夠營養(yǎng)軟骨，主要是通過合成諸多生物活性因子，進而激活血管再生通道［8]。莊超等［9]用自體骨髓間充質干細胞關節(jié)腔注射移植治療兔早期骨性關節(jié)炎模型，結果顯示，實驗組兔軟骨厚度增加幅度優(yōu)于對照組。本次研究結果中，BMSCs和BMSCs+ICA組關節(jié)液中IL-1、TNF-α、MMP-3表達水平較模型組明顯下降，而IL-10水平明顯升高，并且BMSCs+ICA組各項指標的變化幅度均優(yōu)于BMSCs組，這說明骨髓間充質干細胞移植可降低兔骨關節(jié)炎IL-1、TNF-α、MMP-3的表達，抑制炎癥反應，從而減輕關節(jié)軟骨的破壞。

3.3 ICA與BMSCs的關系鮑遠等［10]通過淫羊藿苷干預骨髓間充質干細胞，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷隨時間正向上調runx2、ocn和osx基因的表達，促進BMSCs成骨分化。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，0.1、1、10μmol/L的ICA可提高BMSCs的活性，且各組作用的最佳時間都是72 h，其中1μmol/L的ICA對BMSCs的增殖作用最明顯，100μmol/L的ICA對BMSCs的增殖有抑制作用。

3.4 BMSCs用于治療骨關節(jié)炎的劑量對于BMSCs經關節(jié)腔注射治療骨關節(jié)炎的合適劑量，目前并沒有統(tǒng)一的結論，比較常用的劑量范圍在1×106～10×106/cm2，本次實驗在保證安全和治療效果的前提下，參照其他研究者的研究結果，選擇治療劑量為5×106/cm2［11]。實驗結果顯示，該治療劑量的BMSCs能夠獲得良好的效果。

ICA與BMSCs共育液關節(jié)腔注射可以提高關節(jié)腔內IL-10表達水平，降IL-1、TNF-α、MMP-3表達水平，依此推斷淫羊藿苷可以提高骨髓間充質干細胞活性，可能是通過免疫調節(jié)及炎癥抑制兩種機制調節(jié)關節(jié)腔內紊亂微環(huán)境，緩解軟骨的降解。本實驗提示骨髓間充質干細胞聯(lián)合中藥單體淫羊藿苷關節(jié)腔注射有望成為治療骨關節(jié)炎的有效方案。