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        Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)敲低PEX2轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

        2018-09-21 11:49:14孫瀟蔡夢(mèng)嬌張丹韓蘇夏
        西部醫(yī)學(xué) 2018年9期
        關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體

        孫瀟 蔡夢(mèng)嬌 張丹 韓蘇夏

        (西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科,陜西 西安710061)

        轉(zhuǎn)座子(Transposon)是一類可以在基因組中改變自身位置的DNA序列,改變位置的過程被稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。睡美人(Sleeping Beauty,SB)轉(zhuǎn)座子屬于 Tcl/mariner 家族,近幾年在哺乳動(dòng)物中研究較為廣泛。SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)包括兩端攜帶反向重復(fù)序列(inverted terminal repeat , ITR)的轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的序列,可以進(jìn)行“剪切粘貼”的轉(zhuǎn)座過程,即通過轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座子兩端的反向重復(fù)序列將其剪切,介導(dǎo)轉(zhuǎn)座子整合到基因組中新的位點(diǎn)[1]。SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的應(yīng)用為基因研究的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了新的基因編輯技術(shù)。 Magnani CF等利用SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將含有CD19CAR的轉(zhuǎn)座子插入到細(xì)胞因子誘導(dǎo)型殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cell,CIK cell)的基因組中,形成CARCIK-CD19細(xì)胞,并對(duì)該細(xì)胞治療急性淋巴細(xì)胞白血病進(jìn)行臨床前療效和安全性評(píng)估[2]。Gao B等應(yīng)用SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建骨骼肌細(xì)胞特異性高表達(dá)mIGF-1的小鼠模型,發(fā)現(xiàn) mIGF-1在小鼠骨骼肌中過度表達(dá)可促進(jìn)肌纖維肥大和肌肉產(chǎn)生,并提高成年小鼠的平均體重[3]。Chow EK等結(jié)合SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和水動(dòng)力法尾靜脈注射(Hydrodynamic tail vein injection, HTVI)在小鼠肝臟中通過過表達(dá)原癌基因Myc誘導(dǎo)肝癌形成[4]。

        通過基于CRISPR/Cas9的高通量負(fù)向篩選技術(shù)和自主構(gòu)建的靶向泛素蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)基因的sgRNA亞文庫(kù)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株進(jìn)行高通量負(fù)向篩選(見圖1),發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體生物合成因子2(Peroxisomal Biogenesis Factor 2,PEX2)敲除后可以抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)。PEX2是過氧化物酶體的一種膜蛋白,與PEX10、PEX12構(gòu)成E3泛素連接酶復(fù)合體,通過泛素化PMP70和PEX5參與過氧化物酶體自噬活動(dòng)[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PEX2基因的缺失可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞中過氧化物酶體功能喪失、多種代謝途徑紊亂,同時(shí)可抑制mTOR(The mammalian target of rapamycin)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通絡(luò),最終引起肝癌(Liver cancer)細(xì)胞發(fā)生自噬和死亡[6]。

        為進(jìn)一步了解PEX2在體內(nèi)對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的作用,我們運(yùn)用睡美人( Sleeping Beauty, SB) 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建小鼠肝癌模型,即通過水動(dòng)力法尾靜脈注射向小鼠肝臟導(dǎo)入攜帶原癌基因MYC的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒pT3EF1α-c-Myc和表達(dá)轉(zhuǎn)座酶SB100X的pCMV(CAT)T7-SB100 質(zhì)粒,其中轉(zhuǎn)座酶通過識(shí)別轉(zhuǎn)座子中MYC表達(dá)結(jié)構(gòu)兩側(cè)的反向重復(fù)序列,將其剪切并整合到小鼠肝臟細(xì)胞的基因組中,可以實(shí)現(xiàn)MYC在整合細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。運(yùn)用該種方法成功地在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出肝癌。隨后,我們構(gòu)建了同時(shí)含有針對(duì)PEX2的shRNA序列或?qū)φ誷hNC序列和原癌基因MYC的重組轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),以探索PEX2在體內(nèi)對(duì)肝癌形成的影響。

        圖1 基因篩選模式圖Figure 1 Genetic screening model

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞和小鼠 質(zhì)粒pT3EF1α-c-Myc,pCMV(CAT)T7-SB100 購(gòu)自Addgene公司。質(zhì)粒pLKO.1-shNC和pLKO.1-shPEX2由北京國(guó)家蛋白質(zhì)研究中心分子遺傳實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌Mach1-T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自博邁德公司。小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6由北京國(guó)家蛋白質(zhì)研究中心分子遺傳實(shí)驗(yàn)室保存。6-8周齡小鼠FVB購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

        1.1.2 工具酶和試劑 各種內(nèi)切酶和 T4 連接酶均購(gòu)自 NEB公司, 質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為OMEGA品牌,Lipofectamine 2000 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司。

        1.2 方法

        1.2.1 載體pT3EF1α-GFP的構(gòu)建 以載體pENTRY-EF1α-GFP-Mir為模板、F-EF1α-GFP-AgeI和R-EF1α-GFP-Not I為引物PCR擴(kuò)增EF1α-GFP序列(見表1),瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系為:1μL pENTRY-EF1α-GFP-Mir、1.5μL引物、25μL 2×PCR Buffer for KOD FX、10μL 2mM dNTPs、1μL KOD FX、10μL ddH2O。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 2min;先 98℃變性 10s、 64℃退火 20s、 68℃延伸 90s,重復(fù)變性、退火、延伸30個(gè)循環(huán);最后68℃延伸 10min 終止反應(yīng)。

        用AgeI 和Not I同時(shí)酶切載體pT3EF1α-c-Myc和EF1α-GFP片段,瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物,并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行T4連接,獲得目標(biāo)載體pT3EF1α-GFP。酶切體系為:40μL pT3EF1α-c-Myc或EF1α-GFP片段、5μL cutsmart、2μL AgeI、2μL Not I、1μL ddH2O。T4連接體系:0.5μL 酶切后pT3EF1α-c-Myc、1.5μL 酶切后EF1α-GFP片段、0.5μL T4連接酶、0.5μL T4連接緩沖液、2μL ddH2O。對(duì)獲得的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、挑取單克隆、提質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序,以鑒定載體的正確性。質(zhì)粒提取嚴(yán)格按照OMEGA小提試劑盒步驟進(jìn)行操作。質(zhì)粒測(cè)序委托北京擎科新業(yè)生物有限公司進(jìn)行。

        1.2.2 質(zhì)粒表達(dá)檢測(cè) 小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6接種于6孔培養(yǎng)板中,待密度為40%~60%時(shí),用Lipofectamine 2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,pT3EF1α-c-Myc和pT3EF1α-GFP質(zhì)粒各轉(zhuǎn)染2μg,并于48小時(shí)后收取樣品,提取RNA,通過qPCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定載體pT3EF1α-c-Myc和pT3EF1α-GFP中MYC的表達(dá)。

        1.2.3 SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的MYC過表達(dá)誘導(dǎo)小鼠肝癌預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各五只FVB小鼠,對(duì)照組注射轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒 pT3EF1α-GFP和轉(zhuǎn)座酶SB100X表達(dá)載體pCMV(CAT)T7-SB100 ;實(shí)驗(yàn)組注射轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒 pT3EF1α-c-Myc和轉(zhuǎn)座酶SB100X表達(dá)載體pCMV(CAT)T7-SB100 。質(zhì)粒使用量為:20μg/只,其中轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶載體比例為25∶1。質(zhì)粒溶于格林溶液。注射方法采用水動(dòng)力法尾靜脈注射(Hydrodynamic tail vein injection, HTVI),即在5~9s內(nèi)將質(zhì)粒溶液通過小鼠尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)。

        1.2.4 載體pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2的構(gòu)建 設(shè)計(jì)合成小鼠PEX2基因的shRNA序列shPEX2以及對(duì)照組shNC(見表2),并將其連接入載體pLKO.1中構(gòu)建pLKO.1-shPEX2、pLKO.1-shNC載體。在小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中驗(yàn)證其敲低PEX2的作用。以載體pLKO.1-shNC和pLKO.1-shPEX2為模板,F(xiàn)-U6-shNC-NsiI、R-U6-shNC-PacI和 F-U6-shPEX2-NsiI、R-U6-shPEX2-PacI為引物擴(kuò)增U6-shNC和U6-shPEX2片段(見表1),瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系為: 1μL pLKO.1-shNC載體或pLKO.1-shPEX2、1.5μL引物、 25μL 2×PCR Buffer for KOD FX、10μL 2mM dNTPs、1μL KOD FX、10μL ddH2O。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 2min;先 98℃變性 10s、 64℃退火 20s、 68℃延伸 20s,重復(fù)變性、退火、延伸30個(gè)循環(huán);最后68℃延伸 10min 終止反應(yīng)。

        用NsiI 和PacI同時(shí)酶切載體pT3EF1α-c-Myc和U6-shNC、U6-shPEX2片段,瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物,并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行T4連接,獲得目標(biāo)載體pT3EF1α-c-Myc-shNC和pT3EF1α-c-Myc-shPEX2。酶切體系:40μL pT3EF1α-c-Myc或U6-shNC片段或U6-shPEX2片段、5μL cutsmart、2μL NsiI、2μL PacI、1μL ddH2O。T4連接體系:0.5μL 酶切后pT3EF1α-c-Myc、1.5μL 酶切后U6-shNC片段或U6-shPEX2片段、0.5μL T4連接酶、 0.5μL T4連接緩沖液、2μL ddH2O。

        對(duì)上述獲得的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、挑取單克隆、提質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序,以鑒定載體的正確性。質(zhì)粒提取嚴(yán)格按照OMEGA小提試劑盒步驟進(jìn)行操作。質(zhì)粒測(cè)序委托北京擎科新業(yè)生物有限公司進(jìn)行。

        1.2.5 pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2質(zhì)粒表達(dá)檢測(cè) 小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6接種于 6 孔培養(yǎng)板中,待密度為40%-60%時(shí),用Lipofectamine 2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,每種質(zhì)粒各轉(zhuǎn)染2μg,并于48小時(shí)后收取樣品,提取RNA,通過qPCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組載體pT3EF1α-c-Myc-shPEX2的表達(dá)是否實(shí)現(xiàn)PEX2基因的敲低。

        表1 載體構(gòu)建引物Table 1 The primers for vector

        表2 shRNA序列Table 2 The sequence of shRNA

        2 結(jié)果

        2.1 載體pT3EF1α-GFP的構(gòu)建 以載體pENTRY-EF1α-GFP-Mir為模板擴(kuò)增EF1α-GFP片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),電泳條帶清晰可見,并且與預(yù)期一致,大小為1919bp(見圖2A)。用AgeI 和NotI同時(shí)酶切載體pT3EF1α-c-Myc和EF1α-GFP片段,然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收,并用T4連接酶對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行連接,通過轉(zhuǎn)化對(duì)載體進(jìn)行篩選,挑取單克隆并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序以鑒定載體的正確性。酶切鑒定顯示pT3EF1α-GFP經(jīng)AgeI 和NotI酶切后,獲得大小為3935bp和1912bp的條帶(見圖2B),并且測(cè)序結(jié)果顯示GFP與原序列吻合,說明克隆所得的載體 pT3EF1α-GFP正確。

        圖2 PCR產(chǎn)物(A)與質(zhì)粒pT3EF1α-GFP酶切鑒定(B)

        Figure2TheproductsofPCR(A)andDetectionofpT3EF1α-GFPvector(B)

        2.2 pT3EF1α-GFP和pT3EF1α-c-Myc載體中MYC基因的表達(dá)情況 用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法分別將2μg轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒pT3EF1α-GFP和pT3EF1α-c-Myc轉(zhuǎn)染入小鼠肝癌細(xì)胞Hepa 1-6中,并于48小時(shí)后收取樣品提取RNA檢測(cè)RNA水平MYC基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,載體pT3EF1α-c-Myc中存在MYC表達(dá),而載體pT3EF1α-GFP中無MYC表達(dá)。表明可用pT3EF1α-GFP轉(zhuǎn)座子作為對(duì)照,以比較顯示原癌基因MYC誘導(dǎo)肝癌形成的作用,見圖3。

        2.3 SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的MYC過表達(dá)誘導(dǎo)小鼠肝癌預(yù)實(shí)驗(yàn) 借助SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在肝臟細(xì)胞中通過過表達(dá)原癌基因MYC以誘導(dǎo)肝癌形成。向?qū)嶒?yàn)組注射攜帶MYC基因的pT3EF1α-c-Myc轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒和表達(dá)轉(zhuǎn)座酶SB100X的pCMV(CAT)T7-SB100 質(zhì)粒,轉(zhuǎn)座酶通過識(shí)別轉(zhuǎn)座子載體中MYC表達(dá)結(jié)構(gòu)兩側(cè)的反向重復(fù)序列(ITRs),將其剪切并重新整合到小鼠肝臟細(xì)胞的基因組中,可以實(shí)現(xiàn)MYC在整合細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)照組注射攜帶對(duì)照基因GFP的pT3EF1α-GFP轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒和表達(dá)轉(zhuǎn)座酶SB100X的pCMV(CAT)T7-SB100 質(zhì)粒,以相同的機(jī)制,最終被整合入小鼠肝臟細(xì)胞基因組中的為GFP基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,從注射后第5周開始,實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)荷瘤死亡,而對(duì)照組小鼠未見成瘤(見圖4)。我們成功誘導(dǎo)出肝癌,證明SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的MYC過表達(dá)誘導(dǎo)肝癌形成技術(shù)可行。

        圖3 質(zhì)粒pT3EF1α-GFP與pT3EF1α-c-Myc中MYC的表達(dá)

        Figure3ExpressionofMYCinpT3EF1α-GFPandpT3EF1α-c-Myc

        圖4 SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)MYC誘導(dǎo)小鼠肝癌形成

        Figure4SBtransposonmediatedMYC-inducedlivercancerformationinmice

        注:A.小鼠正常肝臟組織;B.小鼠肝癌組織

        2.4 載體pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2的構(gòu)建 集落形成實(shí)驗(yàn)顯示以pLKO.1-shNC為對(duì)照,載體pLKO.1-shPEX2在小鼠細(xì)胞Hepa1-6中敲低PEX2有效,可抑制該細(xì)胞的增殖(見圖5),證明該shPEX2序列可用。然后以載體pLKO.1-shNC和pLKO.1-shPEX2為模板擴(kuò)增U6-shNC和U6-shPEX2片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),電泳條帶清晰可見,并且與預(yù)期一致,U6-shNC大小為318bp,U6-shPEX2大小為322bp(見圖6A)。用NsiI 和PacI同時(shí)酶切載體pT3EF1α-c-Myc和U6-shNC、U6-shPEX2片段,然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收,并用T4連接酶對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行連接,通過轉(zhuǎn)化對(duì)載體進(jìn)行篩選,挑取單克隆并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序以鑒定載體的正確性。酶切鑒定顯示載體pT3EF1α-c-Myc-shNC和pT3EF1α-c-Myc-shPEX2經(jīng)NsiI 和PacI酶切后,pT3EF1α-c-Myc-shNC獲得大小為6472 bp和310 bp兩個(gè)條帶,pT3EF1α-c-Myc-shPEX2獲得大小為6472 bp和314 bp兩個(gè)條帶(見圖6B),并且測(cè)序結(jié)果顯示U6-shNC和U6-shPEX2與原序列吻合,說明克隆所得的載體pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2正確,載體圖譜,見圖7。

        2.5 載體中PEX2基因的敲低情況 用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法分別將2μg轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞Hepa 1-6,并于48小時(shí)后收取樣品提取RNA檢測(cè)RNA水平上PEX2基因的敲低。結(jié)果顯示,載體pT3EF1α-c-Myc-shPEX2相較于對(duì)照載pT3EF1α-c-Myc-shNC,PEX2基因敲低約40%,見圖8。

        3 討論

        肝癌是目前全球癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因[7],成功構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型,對(duì)探索影響肝癌形成的分子功能進(jìn)而研究人類肝癌的發(fā)生發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。小鼠因遺傳物質(zhì)跟人類相似,有繁殖能力強(qiáng)、生命周期短、基因修飾方便等特點(diǎn),成為重要的模式生物。通過多種方法構(gòu)建小鼠肝癌模型,可為研究肝癌相關(guān)的藥物篩選、肝癌發(fā)生機(jī)制等提供實(shí)驗(yàn)載體。利用化學(xué)物質(zhì)可誘發(fā)肝癌形成,匡志鵬等通過聯(lián)合采用二甲基亞硝胺(DEN)/四氯化碳(CCl4)/乙醇成功誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠肝癌形成[8]。Vartanian V等運(yùn)用黃曲霉毒素(AFB1)誘導(dǎo)出小鼠肝癌[9]?;瘜W(xué)物質(zhì)誘發(fā)肝癌雖在研究中多見,但其致死率較高,并且誘發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)。借助人類或者小鼠肝癌組織或者肝癌細(xì)胞可構(gòu)建小鼠移植肝癌模型。移植部位常見于背側(cè)皮下,肝臟等。張建民等采用直接注射法,將鼠肝癌H22細(xì)胞注射入小鼠肝臟,術(shù)后兩周觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠均可見腫瘤生長(zhǎng)[10]。采用移植法構(gòu)建小鼠肝癌模型成瘤率高,實(shí)驗(yàn)周期短且個(gè)體差異小,但也存在問題。皮下移植瘤因缺乏肝臟特異的生長(zhǎng)環(huán)境,導(dǎo)致皮下移植腫瘤的生物學(xué)行為與肝臟原位腫瘤存在差異,同時(shí)移植瘤多構(gòu)建在免疫力缺陷的裸鼠身上,因此此種模型不適用于肝癌發(fā)展與免疫之間關(guān)系的研究。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建小鼠肝癌模型也應(yīng)運(yùn)而生。人類肝癌的80%是由乙型肝炎病毒(HBV)和或丙型肝炎病毒感染(HCV)所致,借助轉(zhuǎn)基因技術(shù),已成功構(gòu)建出攜帶肝炎病毒編碼基因的小鼠模型。Chisari FV等通過向單個(gè)小鼠受精卵中顯微注射含有HBV表面抗原(HBsAg)和前S和X抗原編碼區(qū)的HBV DNA亞基因組片段,成功構(gòu)建HBV基因攜帶的小鼠模型[11]。Kyoji Moriya等構(gòu)建的HCV核殼蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠,在16個(gè)月的時(shí)候發(fā)展出肝細(xì)胞癌[12]。HBV、HCV慢性攜帶小鼠模型的構(gòu)建,有助于肝炎病毒相關(guān)的肝臟疾病的研究。同時(shí),結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)將原癌基因?qū)胄∈蟾闻K組織,通過原癌基因的表達(dá)作用誘導(dǎo)正常肝臟細(xì)胞癌變,最終形成肝癌的方法也已成功實(shí)現(xiàn)。B Xin等借助水動(dòng)力尾靜脈注射(HTVi)技術(shù)和SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),將AKT和HRAS基因?qū)隒57BL/6J小鼠肝臟細(xì)胞中,并于大約8周時(shí)誘導(dǎo)出肝癌[13],并且發(fā)現(xiàn)MYC基因的活化在AKT和HRAS基因誘導(dǎo)肝癌形成中起著重要作用。Pin Liu等借助水動(dòng)力尾靜脈注射(HTVi)技術(shù)和SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),將原癌基因myc導(dǎo)入FVB/N 小鼠肝臟細(xì)胞中,注射后約6周小鼠出現(xiàn)荷瘤死亡,同時(shí)發(fā)現(xiàn)mTORC1信號(hào)通路活化在MYC誘導(dǎo)小鼠肝癌形成中的關(guān)鍵作用[14]。通過水動(dòng)力尾靜脈注射(HTVi)技術(shù)將質(zhì)粒注射入小鼠體內(nèi),其中肝臟為質(zhì)粒的主要獲取器官,心臟、肺、腎、脾等的質(zhì)粒獲取不足肝臟獲取的0.1%,約10%~40%肝臟細(xì)胞可獲取質(zhì)粒[15],因此水動(dòng)力尾靜脈注射可達(dá)到很好的肝臟靶向性。利用SB轉(zhuǎn)座子技術(shù)可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因在宿主基因組中的整合,以實(shí)現(xiàn)目的基因是長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)合這兩種技術(shù)可將目的基因整合入肝臟細(xì)胞,但最終獲取并能穩(wěn)定表達(dá)目的基因的肝臟細(xì)胞只有2%~10%[15]。腫瘤細(xì)胞周圍圍繞正常肝臟細(xì)胞,更加符合人類肝癌的發(fā)展模式。借助水動(dòng)力尾靜脈注射(HTVi)技術(shù)和SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)使肝臟細(xì)胞過表達(dá)原癌基因MYC,從而誘發(fā)肝癌形成的方法現(xiàn)已比較成熟,并且操作方便、實(shí)驗(yàn)周期短。需要注意的是,遵照SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的機(jī)制,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座子時(shí),為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列能夠被整合到受體基因組中,重組序列必須插入在兩側(cè)反向重復(fù)序列之間。

        圖5 shPEX2的表達(dá)可抑制Hepa1-6細(xì)胞的增殖Figure 5 The expression of shPEX2 can inhibit the proliferation of Hepa1-6 cells

        圖6 PCR產(chǎn)物(A);pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2酶切鑒定(B)Figure 6 The products of PCR (A) ; Detection of pT3EF1α-c-Myc-shNC vector and pT3EF1α-c-Myc-shPEX2 vector (B)

        圖7 質(zhì)粒pT3EF1α-c-Myc和pT3EF1α-c-Myc-shRNA圖譜Figure 7 Map of pT3EF1α-c-Myc and pT3EF1α-c-Myc-shRNA

        圖8質(zhì)粒pT3EF1α-c-Myc-shPEX2可減少Hepa1-6細(xì)胞中PEX2的表達(dá)

        Figure8PlasmidpT3EF1α-c-Myc-shPEX2ReducesPEX2ExpressioninHepa1-6Cells

        4 結(jié)論

        本研究借助 HTVI技術(shù)和SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)過表達(dá)c-Myc成功誘導(dǎo)小鼠肝癌形成,并在SB轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒pT3EF1α-c-Myc基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了可在小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中敲低PEX2基因的重組轉(zhuǎn)基因載體,以探索PEX2在體內(nèi)對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。

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