郝謙 吳慧琴 楊捍衛(wèi)

(中國(guó)人民解放軍武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

急性心肌梗死(AMI)是冠心病中最常見且最致命的病癥。在急診科，對(duì)于AMI的早期診斷及恰當(dāng)?shù)木戎畏绞绞强焖倩謴?fù)心臟血流量以限制心肌壞死程度的重要因素，這在很大程度上影響患者的預(yù)后，降低患者并發(fā)癥發(fā)生率[1]。微小RNA(microRNA，miR)是20～22個(gè)核苷酸組成的小的單鏈非編碼RNA。能夠通過(guò)抑制靶信使RNA的翻譯或誘導(dǎo)其降解來(lái)下調(diào)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)[2]。一些miR可作為心臟功能衰老退化的標(biāo)志基因，也可能是AMI的新型的生物標(biāo)志物[3-4]。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者血漿miR-21水平顯著升高，可能是AMI診斷的新型生物標(biāo)志物。目前有關(guān)miR-21在AMI早期診斷及短期預(yù)后判斷的價(jià)值尚不清楚。本研究比較了AMI患者常規(guī)用于臨床診斷的cTnT與miR-21水平在AMI發(fā)病過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，并探討miR-21對(duì)AMI早期診斷及預(yù)后判斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4月～2016年6月因急性胸痛發(fā)作6h內(nèi)急診入院，且明確診斷為AMI的患者62例，其中急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)42例，急性非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有胸痛癥狀，發(fā)病在6h內(nèi)。②心電圖、心肌標(biāo)志物或心肌酶譜等指標(biāo)符合2007年ACC/AHA制定的心肌梗死標(biāo)準(zhǔn)[6]。③冠脈造影檢查顯示有1支以上的冠脈血管狹窄超過(guò)50%。④經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參加，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因急性創(chuàng)傷引起的胸痛。②肺栓塞、主動(dòng)脈夾層等引起的胸痛。③合并有肝腎功能不全、心臟瓣膜病、急性感染、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等。另選取同期在本院體檢中心體檢健康者30例作為對(duì)照組。

1.2 方法 62例AMI患者分別于入院6h內(nèi)、12h、24h、7d、14d采集靜脈血；30例健康對(duì)照組在清晨空腹采集靜脈血，3000r/min，離心10min，采集上清，置于無(wú)RNA酶的EP管中，-80℃冰箱保存。①cTnT檢測(cè)：cTnT采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Elecsys 2010，Roche公司)進(jìn)行測(cè)定。cTnT>0.1ng/mL為陽(yáng)性，cTnT>0.5ng/mL為AMI診斷參考值。②miR-21檢測(cè)：a.RNA抽提：按照mirVana PARIS試劑盒說(shuō)明書(Ambion公司，美國(guó))分離總RNA。使用NanoDrop ND-1000核酸定量檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度和純度(NanoDrop公司，美國(guó))。b.qRT-PCR：按照TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(Ambion公司，美國(guó))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，定量檢測(cè)血漿樣品中microRNA。qPCR在7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進(jìn)行。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平，使用U6作為miR-21表達(dá)的內(nèi)部對(duì)照。通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血漿miR-21相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 臨床隨訪 通過(guò)門診復(fù)診、電話進(jìn)行定期隨訪，隨訪6個(gè)月，隨訪間隔1個(gè)月，觀察患者隨訪期間主要心血管不良事件(MACE)包括心源性死亡和再發(fā)心肌梗死的發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，兩指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；利用ROC曲線評(píng)價(jià)miR-21診斷AMI的能力。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料的比較 兩組受試者在年齡、性別、血脂等基線特征比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AMI組患者入院6h內(nèi)cTnT水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

2.2 兩組血漿miR-21相對(duì)表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，入院6h內(nèi)血漿miR-21相對(duì)表達(dá)水平在AMI組患者中明顯增高(t=10.096，P=0.000)，見圖1。

2.3 血漿miR-21、cTnT在AMI發(fā)病過(guò)程中的變化 miR-21在入院6h內(nèi)開始增高，12h達(dá)到高峰，24h、7d、14d逐漸下降至接近正常。cTnT在入院6h內(nèi)開始增高，12h逐漸升高，24h達(dá)到高峰，7d、14d逐漸下降至接近正常，見圖2、3。

2.4 相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，發(fā)病初血漿miR-21、cTnT水平呈正相關(guān)(r=0.667，P=0.000)，見圖4。

2.5 血漿miR-21、cTnT對(duì)AMI的診斷價(jià)值 應(yīng)用ROC曲線分析血漿miR-21、cTnT早期診斷AMI的價(jià)值，入院6h以內(nèi)血漿miR-21的ROC曲線下面積(AUC)為0.939(95%CI：0.893～0.984，P=0.000)，當(dāng)miR-21值>3.9時(shí)，敏感度為83.9%，特異度為86.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.9%，陰性預(yù)測(cè)值為72.2%；入院12h時(shí)miR-21的AUC為0.956(95%CI：0.918～0.994，P=0.000)，當(dāng)miR-21值>4.8時(shí)，敏感度為83.9%，特異度為90.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.5%，陰性預(yù)測(cè)值為73.0%；入院6h以內(nèi)cTnT的AUC為0.964(95%CI：0.932～0.996，P=0.000)，當(dāng)cTnT值>0.18時(shí)，敏感度為90.3%，特異度為90.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.9%，陰性預(yù)測(cè)值為81.8%；入院12h時(shí)cTnT的AUC為0.979(95%CI：0.956～1.000，P=0.000)，當(dāng)cTnT值>0.20時(shí)，敏感度為90.3%，特異度為93.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.6%，陰性預(yù)測(cè)值為82.4%，見圖5。

表1 兩組受試者臨床資料的比較Table 1 Comparison of clinical data in each group

2.6 隨訪分析 62例AMI患者隨訪6個(gè)月，有9例患者發(fā)生MACE，其中心源性猝死2例，7例再次發(fā)生AMI；在入院6h內(nèi)、12h、24h、7d、14d時(shí)間段，發(fā)生MACE的患者血漿miR-21相對(duì)表達(dá)水平與未發(fā)生MACE的患者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見圖6。

圖1 入院6h以內(nèi)兩組miR-21相對(duì)表達(dá)水平的比較

Figure1ComparisonofrelativeexpressionlevelsofmiR-21betweenthetwogroupswithin6hadmission

3 討論

研究表明，miR-21參與了心肌梗死的發(fā)病過(guò)程。管文娟等[7]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者外周血miR-21高表達(dá)，AMI組血漿miR-21表達(dá)水平顯著高于心絞痛組，且與冠脈病變的嚴(yán)重程度具有正相關(guān)性。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者血漿miR-21水平顯著升高。

圖2 血漿miR-21水平在AMI發(fā)病過(guò)程中的變化

Figure2ChangesofplasmamiR-21levelsduringthecourseofAMI

圖3 cTnT水平在AMI發(fā)病過(guò)程中的變化Figure 3 cTnT levels in the pathogenesis of AMI

圖4 血漿miR-21與cTnT水平的相關(guān)性分析

Figure4CorrelationAnalysisofPlasmamiR-21andcTnTLevels

圖5 血漿miR-21和cTnT水平對(duì)AMI早期診斷的ROC曲線分析

Fig.5ROCcurveanalysisofplasmamiR-21andcTnTlevelsforearlydiagnosisofAMI

圖6 miR-21在發(fā)生MACE和未發(fā)生MACE患者的波動(dòng)圖

Figure6FluctuationofmiR-21inpatientswithandwithoutMACE

與CK，CK-MB和cTnI相比，miR-21具有相似的診斷AMI能力，可能是AMI診斷的新型生物標(biāo)志物。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)AMI患者血漿miR-21的相對(duì)表達(dá)水平，探討其作為AMI早期診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值。結(jié)果顯示，AMI患者血漿miR-21水平較對(duì)照組明顯增高，miR-21在入院6h內(nèi)開始增高，12h達(dá)到高峰，24h、7d、14d逐漸下降至接近正常。cTnT在入院6h內(nèi)開始增高，12h逐漸升高，24h達(dá)到高峰，7d、14d逐漸下降至接近正常。miR-21與經(jīng)典AMI診斷指標(biāo)cTnT相比，增高更早達(dá)到峰值。此外，miR-21與cTnT呈顯著正相關(guān)。進(jìn)一步采用ROC曲線分析對(duì)miR-21對(duì)AMI的早期診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，入院6h內(nèi)、12h血漿miR-21的 AUC分別為0.939和0.956，入院6h內(nèi)、12h血漿cTnT的AUC分別為0.964和0.979。根據(jù)Swets的診斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)AUC在0.7～0.9之間時(shí)，ROC曲線更準(zhǔn)確，AUC>0.9表示高準(zhǔn)確率。miR-21與cTnT對(duì)AMI的診斷均有較高的敏感度和特異度，對(duì)于AMI具有可靠的診斷價(jià)值，但miR-21的診斷價(jià)值并不優(yōu)于cTnT。

已有研究表明，miR-21在多種心血管疾病中起到重要的作用[9]。miR-21參與心房纖維化和心房顫動(dòng)(AF)的發(fā)生，成纖維細(xì)胞富集miR-21，這有助于心血管系統(tǒng)的纖維化和心力衰竭的發(fā)展。其機(jī)制可能是miR-21通過(guò)上調(diào)WWP-1使TGF-β1/Smad2信號(hào)通路失活來(lái)抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖，是心房纖維性顫動(dòng)中心房纖維化機(jī)制的新的見解[10-11]。研究證實(shí)，在梗死邊緣和梗死區(qū)域的早期階段(6h)中有多種miRNA異常表達(dá)[12]。Darabi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ACS患者血清miR-21水平顯著高于穩(wěn)定型冠狀動(dòng)脈疾病患者，miR-21增高可能通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)來(lái)參與ACS的發(fā)病機(jī)制。而抑制miR-21表達(dá)可通過(guò)M2巨噬細(xì)胞的抗炎作用來(lái)減少支架再狹窄[14]。miR-21參與了冠脈動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程，與調(diào)控炎性因子、促進(jìn)炎癥反應(yīng)來(lái)影響斑塊穩(wěn)定性有關(guān)，miR-21增高導(dǎo)致冠心病患者心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高。本研究中62例AMI患者隨訪6個(gè)月，有9例發(fā)生MACE，在AMI發(fā)病過(guò)程中，不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)生MACE的患者血漿miR-21相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于未發(fā)生MACE的患者，提示miR-21水平增高預(yù)示發(fā)生MACE的風(fēng)險(xiǎn)增高。miR-21對(duì)于AMI患者預(yù)后評(píng)估具有一定的參考價(jià)值。

血漿miR-21顯示出一些診斷心血管疾病的潛力。然而，由于microRNA在生物系統(tǒng)中的復(fù)雜性，除了ACS患者具有不同遺傳、社會(huì)和治療特征之外，其他因素如納入對(duì)象的選擇，樣本量大小也會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成一定的影響[15]。本研究也存在一些不足之處：①患者樣本量偏小且為單中心研究，以及未納入心絞痛患者也都有可能影響研究結(jié)果；②研究發(fā)現(xiàn)，cTnT可以在1年內(nèi)預(yù)測(cè)心肌梗死復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)[16]。本研究隨訪時(shí)間較短，miR-21對(duì)發(fā)生MACE的近期和遠(yuǎn)期預(yù)后判斷缺乏更有力的數(shù)據(jù)支持，這有待于后面的工作進(jìn)一步隨訪觀察分析。③雖然已有研究表明，miR-21在早期診斷AMI具有一定的臨床價(jià)值，但相關(guān)的臨床研究極少，miR-21檢測(cè)和臨床應(yīng)用中的各種問(wèn)題仍有待于進(jìn)一步解決，包括如何快速檢測(cè)出結(jié)果，縮短檢測(cè)時(shí)間，臨界診斷值的界定，以及miR-21水平在風(fēng)險(xiǎn)分層、與冠脈病變嚴(yán)重程度之間的關(guān)系、預(yù)后評(píng)估等問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文資料顯示，血漿miR-21相對(duì)表達(dá)水平在AMI患者中有明顯增高，可能成為早期診斷AMI潛在的新型生物標(biāo)志物。故miR-21水平對(duì)AMI的早期診斷和預(yù)后評(píng)估具有一定的臨床參考價(jià)值，但并不優(yōu)于cTnT檢測(cè)價(jià)值。