韓濤，曹明

(蕪湖市第一人民醫(yī)院，a乳腺外科,b病理科，安徽 蕪湖 241000)

乳腺癌是我國(guó)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率仍呈增高趨勢(shì)[1-2]。晚期乳腺癌可轉(zhuǎn)移至骨、肺等重要臟器，致死率較高，嚴(yán)重威脅我國(guó)女性健康，因此進(jìn)一步探究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、尋找早期診斷與評(píng)估預(yù)后的分子指標(biāo)具有重要意義[3-4]。細(xì)胞自噬作為真核細(xì)胞的自我降解機(jī)制，消除廢舊蛋白、衰老細(xì)胞器及胞內(nèi)病原體以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而自噬功能障礙可作為細(xì)胞癌變的因素之一[5]。微小非編碼RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度僅18～24個(gè)核苷酸、高度保守的單鏈RNA，通過(guò)靶向目的mRNA并使之降解，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控功能，目前已證明多種miRNA參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[6]。在宮頸癌中miR-20a 可通過(guò)降低ATG7的表達(dá)抑制自噬，促進(jìn)宮頸腫瘤的發(fā)生與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，然而miR-20a在乳腺癌中的作用仍有待進(jìn)一步研究[7]。本研究觀察了乳腺癌組織中miR-20a及多種自噬相關(guān)基因的表達(dá)，并利用乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞初步探究了二者的相互作用，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取蕪湖市第一人民醫(yī)院乳腺外科于2016年1月至2017年12月間收治的接受手術(shù)治療的乳腺癌患者56例，年齡(50.9±11.3)歲，年齡范圍為33～82歲，其中右乳手術(shù)21例，左乳35例。患者接受乳腺癌保乳術(shù)31例，改良乳腺癌根治術(shù)20例，腫塊切除術(shù)3例，單純?nèi)榉壳谐g(shù)2例。根據(jù)術(shù)后病理檢查，患者中Luminal A型乳腺癌17例，Luminal B型乳腺癌23例，三陰性乳腺癌9例，Her-2(3+)乳腺癌5例，Her-2(2+)乳腺癌2例。合并高血壓患者8例，合并糖尿病患者3例，所有患者均無(wú)飲酒史或吸煙史。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書(shū)。

1.2材料DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；Alexa Fluor 555標(biāo)記的山羊抗兔IgG、Lipofectamine 2000 Reagent由invitrogen公司提供；mir VanaTMmiRNA Isolation試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。RT cDNA第一鏈合成試劑盒為Frdbio公司產(chǎn)品；焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司，兔抗人Beclin1多克隆抗體、兔源抗LC3多克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。pcDNA3/pri-miR-20a表達(dá)載體由上海Tolo Biotech生物科技有限公司構(gòu)建，所用引物序列為pri-miR-20a-S：5′-GCGAGATCTAGTTGTGCAAATCTATGC-3′、pri-miR-20a-A：5′-GGCGAATTCTAACCA TAGAACAGTGTTC-3′，酶切位點(diǎn)分別為BamH 1、EcoR 1。MCF7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。各引物均由上海生工生物有限公司合成，序列如表1。

1.3方法

1.3.1組織的總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 將乳腺癌患者手術(shù)切取的新鮮腫瘤組織與癌旁組織置于-80 ℃冰箱凍存。提取總RNA時(shí)取適量?jī)龃娼M織，迅速稱重后置于DEPC預(yù)處理的研缽中，加入液氮迅速研磨至粉末狀后，按質(zhì)量體積比為1∶2加入裂解液繼續(xù)勻漿，繼而采用 mir VanaTMmiRNA Isolation試劑盒嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作以提取并純化大片段RNA與小片段RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后凍存于-80℃?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)時(shí)先應(yīng)用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，采用SYBR greenⅠ染料法在LightCycler480 RT-PCR儀上分別檢測(cè)miR-20a及自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3、ATG5及ATG7 mRNA的表達(dá)水平。miR-20a檢測(cè)以U6 snoRNA為內(nèi)參，mRNA檢測(cè)以GAPDH mRNA為內(nèi)參，相對(duì)定量法算得標(biāo)準(zhǔn)曲線及各待檢RNA的相對(duì)表達(dá)量[8]。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物序列

1.3.2脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pcDNA3/pri-miR-20a至MCF7細(xì)胞 乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞采用含10%胎牛血清與10 U·mL-1青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。常規(guī)條件下培養(yǎng)細(xì)胞至融合率約85%，以細(xì)胞消化液消化細(xì)胞并按2×105個(gè)每孔接種至六孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)12 h。3 μg·mL-1的pcDNA3/pri-miR-20a質(zhì)粒與pcDNA3空白質(zhì)粒分別按質(zhì)量體積比1∶3與Lipofectamine 2000 Reagent混懸并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.3.3免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF7細(xì)胞Beclin 1與饑餓條件下LC3Ⅱ的表達(dá) MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基并以預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液充分吹打細(xì)胞，并置于水平搖床平搖20 min后獲得裂解產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移至EP管后以15 000 r·min-1低溫離心15 min，收集上清并加入上樣緩沖液，煮沸5 min并冷卻后，樣本按等體積進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離。電轉(zhuǎn)至PVDF膜并封閉后，采用兔抗人Beclin 1單克隆抗體或兔抗人GAPDH單克隆抗體按1∶1 000稀釋后孵育PVDF膜，在4 ℃水平搖床慢搖10 h后洗膜，爾后加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯示信號(hào)。成像系統(tǒng)采集圖像后，分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)饑餓條件下MCF7細(xì)胞LC3Ⅱ的表達(dá)前，棄去轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入Hank′平衡鹽溶液處理20 min后進(jìn)行LC3Ⅱ的免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。一抗孵育時(shí)采用1∶1 000稀釋的兔源抗LC3多克隆抗體，其他條件與檢測(cè)Beclin 1時(shí)相同。

1.3.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察饑餓條件下MCF7細(xì)胞LC3蛋白的分布 MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3/pri-miR-20a質(zhì)?；騪cDNA3空白質(zhì)粒后，采用Hank′平衡鹽溶液饑餓細(xì)胞。20 min后棄去溶液，輕柔滴加預(yù)冷的甲醇，爾后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于-20 ℃冰箱固定細(xì)胞20 min。棄去甲醇，滴加3% BSA并于37 ℃恒溫箱封閉60 min，繼而以1∶300稀釋的兔源LC3多克隆抗體于37 ℃孵育60 min，PBST洗滌后加入Alexa Fluor 555標(biāo)記的山羊抗兔 IgG。室溫孵育60 min后以0.01 μg·mL-1DAPI溶液對(duì)細(xì)胞核著色，用熒光倒置顯微鏡觀察圖像。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌組織中miR-20a的表達(dá)高于癌旁組織

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)對(duì)56例乳腺癌患者腫瘤組織與癌旁組織的miR-20a表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織miR-20a的平均表達(dá)水平為211.35±67.43，明顯高于癌旁組織126.72±24.37，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，初步表明miR-20a的表達(dá)上調(diào)與乳腺癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。

2.2乳腺癌組織中Beclin1mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織在檢測(cè)miR-20a表達(dá)的同時(shí)，我們還采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了6例患者腫瘤組織與癌旁組織4種自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示該組患者腫瘤組織Beclin1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織(P<0.05)，而ATG5、ATG7及ATG12 mRNA表達(dá)水平的兩組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌與癌旁組織中4種自噬相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.3過(guò)表達(dá)miR-20a抑制MCF7細(xì)胞Beclin1的表達(dá)為探究乳腺癌組織中miR-20a表達(dá)升高是否參與Beclin1 mRNA表達(dá)水平的下調(diào)，我們采用乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3/pri-miR-20a重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá)miR-20a，以表達(dá)載體pcDNA3質(zhì)粒作為對(duì)照，免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Beclin1表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-20a后MCF7細(xì)胞Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.18±0.12，較載體對(duì)照組0.72±0.11及空白對(duì)照組0.70±0.45細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，而載體對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

2.4過(guò)表達(dá)miR-20a抑制饑餓條件下MCF7細(xì)胞LC3Ⅱ的表達(dá)在自噬通路激活與自噬體構(gòu)建的過(guò)程中，Beclin1作為調(diào)節(jié)分子發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。為觀察乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞系中Beclin1表達(dá)下調(diào)對(duì)自噬功能的影響，我們采用Hank′平衡鹽溶液替代培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，進(jìn)而檢測(cè)功能狀態(tài)下的自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)水平。免疫蛋白印記顯示過(guò)表達(dá)miR-20a后，饑餓刺激下的MCF7細(xì)胞LC3Ⅱ的表達(dá)量低于載體對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞，顯示其自噬活化受到抑制(圖2)。

2.5過(guò)表達(dá)miR-20a抑制饑餓條件下MCF7細(xì)胞的自噬體構(gòu)建自噬體的構(gòu)建是顯示自噬水平增高的重要依據(jù)，因此我們采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)標(biāo)記自噬體膜蛋白LC3，根據(jù)LC3聚集為斑點(diǎn)狀反映自噬體形成。熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)，通過(guò)饑餓誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞自噬后載體對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞中分布大量紅色熒光斑點(diǎn)，而過(guò)表達(dá)miR-20a后MCF7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)之中紅色斑點(diǎn)較少，進(jìn)一步反映了miR-20a抑制MCF7細(xì)胞的自噬活化(圖3)。

3 討論

近年來(lái)，對(duì)于miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究愈加廣泛和深入。其中，miR-20a參與了多種癌癥進(jìn)展的分子病理過(guò)程[9]。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-20a通過(guò)靶向早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白2促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散與侵襲[10]，并且患者外周血中高循環(huán)miR-20a與非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)[11]。此外，有證據(jù)顯示miR-20a參與了對(duì)細(xì)胞自噬功能的負(fù)向調(diào)節(jié)。Guo L等[12]發(fā)現(xiàn)miR-20a通過(guò)降低巨噬細(xì)胞ATG7 與 ATG16L1的表達(dá)抑制自噬，從而有助于結(jié)核分支桿菌的存活，而Li S等[13]報(bào)道了在乳腺癌中miR-20a可靶向于RB1CC1/FIP200復(fù)合物降低自噬水平。為進(jìn)一步探究miR-20a在乳腺癌中扮演的角色，我們首先檢測(cè)了乳腺癌組織中miR-20a的表達(dá)水平。與先前的報(bào)道一致，乳腺癌組織中miR-20a的平均相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織。

此外，我們檢測(cè)了Beclin1、Atg5、Atg7及Atg12共4種自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，腫瘤組織Beclin1 mRNA的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，而Atg5、Atg7與Atg12 mRNA表達(dá)量的兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前認(rèn)為，細(xì)胞自噬對(duì)腫瘤的發(fā)生與生長(zhǎng)具有雙向作用。由于腫瘤組織代謝旺盛，生長(zhǎng)較快時(shí)能量需求更高，在周?chē)h(huán)境提供能量不足時(shí)自噬可通過(guò)降解長(zhǎng)壽命蛋白為其提供營(yíng)養(yǎng)，維持腫瘤細(xì)胞的存活。特別在患者接受放療或化療時(shí)，物理及化療藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用和細(xì)胞功能的干擾，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的大量損傷[14]。而自噬活化可對(duì)其降解為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并再利用，在放化療的應(yīng)激條件下對(duì)癌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。與此同時(shí)，自噬對(duì)腫瘤的發(fā)生具有抑制作用，自噬水平過(guò)低可增加DNA損傷與基因突變，而B(niǎo)eclin1是第一個(gè)被確認(rèn)的自噬相關(guān)抑癌基因[15-16]。

在觀察到乳腺癌組織中miR-20a表達(dá)升高與Beclin1 mRNA表達(dá)降低后，我們利用了乳腺癌細(xì)胞系MCF7探究了二者之間的相互關(guān)系。通過(guò)重組質(zhì)粒載體過(guò)表達(dá)miR-20a后，免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)顯示Beclin1蛋白表達(dá)水平降低。進(jìn)而，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-20a后MCF7細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量與自噬體數(shù)量均明顯降低，顯示miR-20a對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的自噬功能具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)了在乳腺癌中miR-20a通過(guò)降低自噬調(diào)節(jié)蛋白Beclin1的表達(dá)以抑制自噬的作用。后續(xù)我們將進(jìn)一步探究miR-20a與Beclin1 mRNA的直接相互作用，為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。

(本文圖1～3見(jiàn)插圖10-2)