童俊露，王佑民，鄧大同

(1.泰康仙林鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210046；2.安徽醫(yī)科大學內(nèi)分泌與代謝病研究所，安徽 合肥 230022；3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽 合肥 230022)

近年來，隨著生活日益改善，肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征等內(nèi)分泌代謝病的發(fā)病率明顯增加，胰島素抵抗是這些疾病共同的發(fā)病機制。脂聯(lián)素(APN)作為脂肪因子可調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和葡萄糖代謝，目前作為骨骼肌因子的研究正在探索中。葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)是骨骼肌以及脂肪細胞中最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體，亦可調(diào)節(jié)糖脂代謝。二甲雙胍及運動是最常用的改善胰島素抵抗的方法。本研究通過高脂飲食建立肥胖及胰島素抵抗模型，了解二甲雙胍及運動干預(yù)對骨骼肌中APN和GLUT4表達產(chǎn)生的影響，探討APN及GLUT4在骨骼肌糖代謝中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物雄性4周齡清潔級SD大鼠50只，購自安徽醫(yī)科大學動物實驗室。本研究符合一般動物實驗倫理的要求。本研究起止時間為2013年1月至2016年9月。

1.2飼料普通飼料(動物中心配制)，成分配比為：豆粕30%、高粱10%、玉米30%、標準粉10%、魚粉10%、骨粉2.5%、酵母2.5%、黃豆5%；高脂飼料成分配比為：普通飼料55%、豬油12%、麻油3%、雞蛋10%、花生5%、蔗糖5%、奶粉8%、食鹽2%。

1.3試劑及儀器鼠胰島素放免試劑盒(北京北方生物研究所)；BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物研究所)；兔抗鼠APN(Acrp30)抗體、兔抗鼠GLUT4抗體(均為美國BIOWORLD公司)、β-actin一抗(美國 Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗及兔抗鼠二抗(均為北京中杉金橋生物有限公司)；鹽酸二甲雙胍腸溶片(施貴寶公司提供)；全自動生化分析儀(瑞士Roche Modular DPP公司)。

1.4大鼠飼養(yǎng)及干預(yù)分組50只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法，分為普通對照組(NC組，11只)和高脂飼料組(HD組，39只)。NC組給予普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，HD組大鼠換為高脂飼料喂養(yǎng)，定期稱重，12周后，篩選36只造模成功的肥胖大鼠(體質(zhì)量高于NC組20%認為造模成功)采用隨機數(shù)字表法分為游泳運動組(SE組，10只)、二甲雙胍組(MT組，11只)、高脂肥胖組(HF組，11只)，另有7只大鼠在實驗過程中因溺水、灌胃嗆咳等原因死亡。SE組大鼠每天下午3點進行游泳運動，泳池為高1.5 m，直徑2 m的圓柱形容器，運動時維持水溫在(23±2)℃，每周6天，第1周每天20 min，之后每周每天增加15 min，直至每天1 h。MT組大鼠每只每天給予200 mg·kg-1的二甲雙胍溶液灌胃，二甲雙胍溶液為注射用水新鮮配制的混懸液，每只大鼠灌胃體積2 mL左右。所有大鼠均可自由進食，自由進水，生活環(huán)境溫度為(25±1)℃，共干預(yù)6周。

1.5血清指標檢測禁食8 h過夜，10%水合氯醛麻醉，稱量體質(zhì)量(BW)，下腔靜脈采血，2 500 r·min-1離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱中保存以備測定各項代謝指標。分離腓腸肌組織，液氮中凍存。

使用全自動生化儀測各項指標：空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TCH)?？崭挂葝u素(FINS)水平使用鼠胰島素放免試劑盒測定。

計算胰島素抵抗指數(shù)：(HOMA-IR)=FBG(mmol·L-1)×FINS(mIU·L-1)/22.5。

1.6骨骼肌組織中APN、GLUT4的蛋白表達的程度取約100 mg的腓腸肌組織，冰上勻漿后加入細胞裂解液充分裂解，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，使用BCA試劑盒測定蛋白含量，標記后置于-80 ℃保存。取等量蛋白沸水煮5～10 min變性后加樣，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至NC膜上，TBST封閉，分別加入APN(Acrp30)一抗(1∶300)、GLUT4一抗(1∶1 000)及β-actin 一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)孵育2 h，ECL曝光、顯影、定影，蛋白質(zhì)印跡法所得條帶使用凝膠處理軟件掃描成圖片，分析目標條帶灰度值。骨骼肌中的APN、GLUT4的灰度值與 β-actin的灰度值比值為蛋白的相對表達量，進行統(tǒng)計學分析。

表1 各組大鼠代謝相關(guān)指標的測定

注：整體分析為單因素方差分析；多重比較為HSD-t檢驗，角標a、b、c分別為與A、B、C組比較，P<0.05

2 結(jié)果

2.1血清學指標兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：與正常對照(NC組)相比較，HF組大鼠的BW、FBG、TG、TCH、FINS、HOMA-IR指數(shù)均明顯增高(P<0.05)。與HF組相比，SE、MT組BW、FBG、TCH、HOMA-IR指數(shù)下降(P<0.05)，SE組血TG下降(P<0.05)，MT組血中TG雖有所下降但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組大鼠骨骼肌組織中APN、GLUT4的蛋白表達兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：與NC組相比，HF組骨骼肌中APN、GLUT4的蛋白表達量明顯降低(P<0.05)；與HF組比較，SE組及MT組骨骼肌組織中GLUT4的表達均明顯增加(P<0.05)；與HF組相比，SE、MT組骨骼肌組織中APN的表達明顯增加(P<0.05)；SE組、MT組之間GLUT4的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表2。

表2 各組間大鼠骨骼肌組織APN、GLUT4蛋白表達比較

注：整體分析為單因素方差分析；多重比較為HSD-t檢驗，角標a、b、c分別為與A、B、C組比較，P<0.05

3 討論

胰島素抵抗是指機體對胰島素的敏感性下降，是2型糖尿病、代謝綜合征等內(nèi)分泌相關(guān)疾病主要的發(fā)病機制，改善胰島素抵抗，是多種疾病防治的核心。高脂飲食誘導大鼠肥胖及胰島素抵抗的發(fā)生與人類肥胖及胰島素抵抗的發(fā)病過程相類似，通常用于建立動物模型。本實驗研究亦采用了這種方法造模，與普通對照大鼠相比，高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體質(zhì)量增加大于20%，HOMA-IR指數(shù)明顯增高，F(xiàn)BG、TG、TCH增高，F(xiàn)INS水平增加，提示肥胖及胰島素抵抗大鼠造模成功。

APN最早在脂肪組織中發(fā)現(xiàn)，作為脂肪因子與脂聯(lián)素受體結(jié)合可降低FBG、TG水平，調(diào)節(jié)糖脂代謝，具有改善胰島素敏感性、抗動脈粥樣硬化等保護作用[1]。近年來，在骨骼肌中也發(fā)現(xiàn)APN的表達，骨骼肌中APN的表達和調(diào)節(jié)是目前研究新方向。Esfahani等[2]多位學者在大鼠及人類的骨骼肌組織中均發(fā)現(xiàn)了APN的存在，有學者證實骨骼肌可以通過分泌APN，上調(diào)脂肪酸的氧化應(yīng)激，減少三酰甘油含量，促進骨骼肌細胞中葡萄糖氧化，改善胰島素敏感性。骨骼肌細胞膜GLUT4介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運是糖代謝中的限速步驟，在糖尿病SD大鼠模型中，GLUT4的高表達明顯降低其空腹血糖[3]。體外實驗顯示，在高胰島素的環(huán)境中骨骼肌細胞GLUT4的表達明顯降低，且同時伴發(fā)轉(zhuǎn)位障礙[4]。GLUT4在骨骼肌細胞膜中的轉(zhuǎn)位途徑有兩種類型：(1)胰島素依賴型途徑：胰島素及胰島素類似物與胰島素受體結(jié)合，激活GLUT4發(fā)生膜轉(zhuǎn)位；(2)非胰島素依賴性途徑：由于運動、缺血、缺氧等因素，直接激活GLUT4膜轉(zhuǎn)位過程[5-7]。高脂喂養(yǎng)的SD大鼠骨骼肌組織中，胰島素信號轉(zhuǎn)導途徑中受體水平缺陷，使得GLUT4mRNA表達明顯下降和GLUT4蛋白含量降低，從而導致葡萄糖轉(zhuǎn)運、攝取、利用的減少及胰島素抵抗的發(fā)生[8]。本研究結(jié)果得出類似結(jié)論，高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖胰島素抵抗大鼠的血糖、血脂較正常對照組明顯增加，骨骼肌中APN及GLUT4明顯降低，證實了APN和GLUT4的下調(diào)與胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂相關(guān)。

運動鍛煉是臨床中最常見改善胰島素抵抗的生活調(diào)節(jié)方式。運動可以直接增加機體骨骼肌中GLUT4的表達和蛋白質(zhì)的合成，促進GLUT4跨膜轉(zhuǎn)運過程；增加骨骼肌細胞膜上胰島素受體數(shù)量，使得胰島素與受體結(jié)合增加，促進骨骼肌細胞GLUT4的膜轉(zhuǎn)運，使GLUT4的含量提高；在運動鍛煉肌肉收縮過程中，增加了細胞內(nèi)鈣離子含量，從而激活了鈣調(diào)蛋白激酶活性來增加GLUT4的表達；同時運動過程中由于體內(nèi)的ATP大量消耗，AMP的增加激活了AMPK介導的信號轉(zhuǎn)導途徑，GLUT4的膜轉(zhuǎn)位增加，肌肉組織攝取和利用葡萄糖增加，從而改善胰島素抵抗[9-11]。在本實驗中，SE組較HF組FBG、TG、TCH下降，HOMA指數(shù)降低，骨骼肌中GLUT4的表達明顯增高，進一步證實運動可以增加GLUT4的表達。目前針對運動對APN水平的影響尚有爭議，有學者發(fā)現(xiàn)運動不能改變APN的水平，可能不是運動改善胰島素敏感性的因子之一；國內(nèi)另有研究發(fā)現(xiàn)，運動對血清及骨骼肌中APN均有上調(diào)作用[12]。在本研究中，SE組骨骼肌中APN表達較HF組明顯增高，血脂、血糖降低，胰島素抵抗改善，具體機制尚不明確，考慮可能與運動激活A(yù)MPK等信號通路有關(guān)，進一步促進GLUT4的轉(zhuǎn)位。

二甲雙胍是臨床上最常用于改善胰島素抵抗的藥物，可以抑制糖異生，增加外周組織對葡萄糖的攝取和利用，提高胰島素敏感性。二甲雙胍可增加糖尿病模型中骨骼肌中GLUT4 mRNA和蛋白表達，促進胰島素介導的骨骼肌GLUT4跨膜轉(zhuǎn)運，增加外周組織對葡萄糖攝取促進。本研究在肥胖大鼠胰島素抵抗模型中亦得到上述結(jié)論，二甲雙胍干預(yù)的MT組大鼠骨骼肌組織中GLUT4的表達較HF組明顯增加，作用機制可能為二甲雙胍在改善胰島素抵抗的同時可能直接促進GLUT4的表達。有關(guān)二甲雙胍對組織APN表達的影響尚存不同的觀點。Zulian 等[13]通過體內(nèi)、體外實驗證明二甲雙胍可增加脂肪細胞和脂肪組織中APN的表達。有研究認為，二甲雙胍對血清APN無明顯改善作用[14]，但國內(nèi)有學者研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可升高2型糖尿病患者中血清APN的水平[15]。二甲雙胍對骨骼肌細胞和組織中的APN的表達作用目前報道較少。

本實驗中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可增加骨骼肌GLUT4的表達，改善胰島素抵抗和糖脂代謝，但并未顯著增加骨骼肌APN的表達，具體機制目前尚不十分明確，但由于本實驗干預(yù)時間短，樣本量較小，二甲雙胍及運動對骨骼肌APN的作用有待今后進一步探討研究。

(本文圖1見插圖10-1)