許樂(lè)義

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阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似物組分A形成機(jī)制研究及其制備

許樂(lè)義

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310000）

對(duì)形成阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似物組分A的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探究，并對(duì)其克級(jí)樣品的制備進(jìn)行了首次嘗試。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，形成組分A的主要原因來(lái)自于阿卡波糖的異構(gòu)化，而且該過(guò)程對(duì)于菌絲體的參與并不依賴。針對(duì)于這一發(fā)現(xiàn)，建立了對(duì)阿卡波糖進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)，從而獲得組分A的獲取方法，并通過(guò)不斷試驗(yàn)得到了使組分A達(dá)到最高獲得率的條件數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)中性氧化鋁以及強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換的層析，從異構(gòu)化的反應(yīng)液中獲得了高純度的組分A，為發(fā)酵液中雜質(zhì)組分A的去除分離等后續(xù)系統(tǒng)的研究提供了材料。

阿卡波糖；結(jié)構(gòu)類似物；發(fā)酵液；脫色專用樹(shù)脂

本文對(duì)形成雜質(zhì)組分A的機(jī)制進(jìn)行嘗試性的解析，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)如何制備組分A進(jìn)行方法探究并建立相應(yīng)規(guī)則，以期獲得組分A在克級(jí)上的標(biāo)本，對(duì)于發(fā)酵液中雜質(zhì)組分A的去除分離等后續(xù)系統(tǒng)的研究提供了材料。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

試驗(yàn)研究所需要的材料包括阿卡波糖、相關(guān)填料、中性層析氧化鋁、WD-脫色專用樹(shù)脂、色譜純已腈等；所需要的儀器設(shè)備主要包括高效液相色譜儀、高壓層析系統(tǒng)等。這些材料都可通過(guò)采購(gòu)獲得。

1.2 組分A的制備

1.2.1 pH值因素

分別采用定量的HC1溶液和NaOH溶液用以對(duì)阿卡波糖溶液的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，以使配置出來(lái)的阿卡波糖溶液是標(biāo)準(zhǔn)的。配置好標(biāo)準(zhǔn)溶液之后，在設(shè)定好的外界輔助條件的配合下，對(duì)其進(jìn)行異構(gòu)反應(yīng)，并在過(guò)程中進(jìn)行取樣，以便于對(duì)阿卡波糖的含量和雜質(zhì)A的含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 溫度因素

僅使用NaOH溶液對(duì)阿卡波糖溶液進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)至一定的pH值之后，在設(shè)定好的外界輔助條件的配合下，對(duì)其進(jìn)行異構(gòu)反應(yīng)，并在過(guò)程中進(jìn)行取樣，以便于對(duì)阿卡波糖的含量和雜質(zhì)A的含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 組分A的分離

1.3.1 Macro-prcp High S柱層析

在層析柱中填充一定的強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的床體積，并將其在高壓層析系統(tǒng)上進(jìn)行固定。用超純水對(duì)填充柱進(jìn)行充分平衡后，以相應(yīng)的流速將定量、經(jīng)過(guò)樹(shù)脂進(jìn)行脫色和微濾處理過(guò)的轉(zhuǎn)化液泵入強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂填充柱中；進(jìn)行樣本化，并用超純水對(duì)其進(jìn)行淋洗，直至基線趨于平穩(wěn)；用HC1溶液對(duì)其進(jìn)行繼續(xù)洗脫，并對(duì)洗脫液進(jìn)行收集，分析洗脫液中各成分的組成及其相應(yīng)含量。

1.3.2 中性氧化鋁柱層析

通過(guò)濕法的方法，將中性氧化鋁的粉末按照一定量的標(biāo)準(zhǔn)裝進(jìn)層析柱中，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的床體積，并將其在高壓層析系統(tǒng)上進(jìn)行固定。經(jīng)超純水對(duì)填充柱進(jìn)行充分的平衡之后，以相應(yīng)的流速將定量的上述洗脫液泵入相應(yīng)的中性氧化鋁的填充柱中；進(jìn)行樣本化，并用超純水對(duì)其進(jìn)行淋洗，直至基線趨于平穩(wěn)；使用超純水對(duì)其進(jìn)行繼續(xù)洗脫，并對(duì)洗脫液進(jìn)行收集，分析洗脫液中各成分的組成及其相應(yīng)含量。

1.3.3 冷凍干燥

經(jīng)過(guò)上述過(guò)程得到洗脫液后，對(duì)其中含有較高組分A的洗脫液進(jìn)行合并，然后通過(guò)減壓濃縮的方式去除部分水分，并按照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的冷凍，最后通過(guò)對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥的方法，獲得組分A的樣品。

1.4 分析方法

1.4.1 對(duì)阿卡波糖進(jìn)行測(cè)定的方法

利用水膜對(duì)樣品進(jìn)行微濾之后，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.4.2 對(duì)組分A進(jìn)行測(cè)定的方法

檢測(cè)按照歐洲藥典的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 通過(guò)異構(gòu)化反應(yīng)對(duì)組分A進(jìn)行制備

2.1.1 LC-MS分析

在標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定條件下，對(duì)阿卡波糖溶液進(jìn)行一段時(shí)間的處理；在反應(yīng)液中會(huì)有4類物質(zhì)生成，將其分別標(biāo)注為Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)、Ⅳ類物質(zhì)。通過(guò)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析后發(fā)現(xiàn)，殘留在反應(yīng)液中的阿卡波糖的相對(duì)分子量等同于Ⅳ類物質(zhì)的相對(duì)分子量，由此證明Ⅳ類物質(zhì)為阿卡波糖的同分異構(gòu)體。同時(shí)，在出峰時(shí)間上進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，相比于阿卡波糖，組分A是其0.9倍，并對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行參考比較，得出了Ⅳ類物質(zhì)即為雜質(zhì)組分A的結(jié)論。這也從側(cè)面論證了形成組分A的原因之一就是阿卡波糖的異構(gòu)化反應(yīng)，且在此過(guò)程中，可能并不依賴于菌絲體參與。

2.1.2 阿卡波糖異構(gòu)化反應(yīng)中pH值的影響

經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)表明，pH值對(duì)反應(yīng)液中通過(guò)阿卡波糖異構(gòu)化的作用生成組分A在效率上有明顯的影響。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析觀察到，當(dāng)pH等于11時(shí)，通過(guò)異構(gòu)化的反應(yīng)可獲得最多的組分A，并在3 h內(nèi)異構(gòu)化的反應(yīng)趨于平衡，如圖1所示；當(dāng)pH等于12時(shí)，對(duì)于組分A的初反應(yīng)的形成速度是最快的，但反應(yīng)過(guò)程隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，組分A的含量出現(xiàn)逐步下降的情況，同時(shí)，Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)的生成含量相比于其他處理組織也呈現(xiàn)出明顯增多的現(xiàn)象。由此可以確定，在阿卡波糖異構(gòu)化的反應(yīng)過(guò)程中，pH值應(yīng)設(shè)定為11.

圖1 pH對(duì)阿卡波糖異構(gòu)化反應(yīng)的影響

2.1.3 異構(gòu)化的反應(yīng)過(guò)程中溫度的影響

經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在一定的設(shè)定溫度區(qū)間內(nèi)，隨著溫度的升高，對(duì)阿卡波糖的異構(gòu)化反應(yīng)用于生成組分A這一過(guò)程越來(lái)越有利，并對(duì)其反應(yīng)速度也有明顯的加速提升作用。這一溫度區(qū)間為30～70 ℃，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的線性化曲線表現(xiàn)不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃之后，曲線趨于平穩(wěn)，溫度對(duì)反應(yīng)過(guò)程的影響開(kāi)始變小。同時(shí)，對(duì)反應(yīng)過(guò)程中生成的Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)進(jìn)行了溫度影響的研究。研究數(shù)據(jù)表明，隨著溫度的升高，Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)的生成不斷加快，其中，Ⅱ類物質(zhì)受溫度影響的變化最為明顯，同樣，對(duì)其相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性化，得到其二維曲線圖。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在設(shè)定60 ℃和70 ℃溫度條件下，對(duì)于生成的組分A的含量進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)組分A的含量進(jìn)本持平，但是在對(duì)2個(gè)溫度下生成的3種雜質(zhì)含量進(jìn)行對(duì)比時(shí)發(fā)現(xiàn)，60 ℃下的生成量低于70 ℃下的生成量，由此可以確定，在阿卡波糖異構(gòu)化的反應(yīng)過(guò)程中，60 ℃為最優(yōu)反應(yīng)設(shè)定溫度。

2.1.4 異構(gòu)化的反應(yīng)過(guò)程中菌絲體的影響

經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明，在設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)外界輔助環(huán)境中，通過(guò)阿卡波糖的異構(gòu)化反應(yīng)獲得組分A的這一反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)自發(fā)進(jìn)行，但是存在著其異構(gòu)化反應(yīng)不是非常明顯的情況。通過(guò)在反應(yīng)液中分別添加菌絲體以及菌絲體裂解液，從而達(dá)到對(duì)轉(zhuǎn)化阿卡波糖這一過(guò)程的促進(jìn)作用，但這一方法對(duì)生成組分A的影響微乎其微。除此之外，對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)整發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH等于11時(shí)，對(duì)通過(guò)阿卡波糖的異構(gòu)化反應(yīng)生成組分A這一反應(yīng)有明顯的強(qiáng)化作用。

2.2 對(duì)組分A的提取

2.2.1 Macro-prcp High S柱層析

由于組分A與阿卡波糖為同分異構(gòu)體，因此，阿卡波糖所含有的阿卡維基機(jī)構(gòu)其同分異構(gòu)體的組分A也同樣具有，在理論層面上，對(duì)組分A也同樣能夠通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的方法實(shí)現(xiàn)吸附分離。試驗(yàn)中，通過(guò)使用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換劑實(shí)現(xiàn)對(duì)阿卡波糖以及組分A的吸附；采用HC1溶液洗脫的方法對(duì)其進(jìn)行處理。經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)的觀察以及對(duì)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，組分A具有較弱的結(jié)合樹(shù)脂的能力，最先被洗脫，隨后Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)被洗脫。利用離子交換層析的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)的去除，并使Ⅲ類物質(zhì)的含量降低，從而獲得去除雜質(zhì)的只包含阿卡波糖和組分A的洗脫液，但是這一方法不能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)阿卡波糖和組分A的分類。

2.2.2 中性氧化鋁柱層析

通過(guò)利用中性氧化鋁與組分A空間結(jié)構(gòu)不同的原理，嘗試?yán)弥行匝趸X層析柱實(shí)現(xiàn)對(duì)阿卡波糖以及組分A分離，效果明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這一方法可以有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)阿卡波糖以及組分A的分離以及純度的提高。通過(guò)強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換層析、中性氧化鋁層析方法分步驟實(shí)現(xiàn)了對(duì)組分A的樣品提取，為后續(xù)其相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)材料。

3 結(jié)束語(yǔ)

本文通過(guò)結(jié)合理論實(shí)驗(yàn)以及對(duì)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，得到了制備阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似物組分A的制備原理，并獲得了相應(yīng)的克級(jí)樣本，為組分A的分類去除提供了參考，為組分A的制備提供了理論依據(jù)，為組分A的后續(xù)研究工作提供了樣本。

［1］王亞軍，董方智，于蕾，等.陽(yáng)離子交換樹(shù)脂SAC 001×7對(duì)阿卡波糖的吸附性能研究［J］.高校化學(xué)工程學(xué)報(bào)， 2012（03）：493-498.

［2］梁現(xiàn)蕊，張會(huì)晨，何小媛，等.阿卡波糖中雜質(zhì)的分離富集方法研究［J］.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017（03）：49-50.

2095－6835（2018）18－0136－02

TQ920.1

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2018.18.136

〔編輯：張思楠〕