黃建平，鄭燕

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阿卡波糖產(chǎn)生菌的選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化

黃建平，鄭燕

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310000）

通過實(shí)驗(yàn)分析對(duì)阿卡波糖產(chǎn)生菌的選育與發(fā)酵工藝優(yōu)化進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對(duì)阿卡波糖產(chǎn)生菌采取紫外以及NTG等誘變處理后進(jìn)行雜質(zhì)組分較低的高產(chǎn)突變株SIPI-AK篩選，其發(fā)酵水平能夠明顯提升約36%，并且在對(duì)罐上補(bǔ)料工藝進(jìn)行優(yōu)化后，能夠達(dá)到質(zhì)量濃度在3 100 μg/ mL以上的發(fā)酵工藝效果，同時(shí)，對(duì)雜質(zhì)C組分生成具有抑制作用，效果十分明顯。

阿卡波糖；生產(chǎn)菌；工藝優(yōu)化；糖尿病

阿卡波糖作為有效的α-葡糖苷酶抑制劑，在Ⅱ型糖尿病臨床治療中應(yīng)用較多。值得注意的是，阿卡波糖產(chǎn)生菌選育發(fā)酵過程中，游動(dòng)放線菌在實(shí)現(xiàn)阿卡波糖發(fā)酵生產(chǎn)的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生一系列異構(gòu)體雜質(zhì)，而藥典中對(duì)阿卡波糖雜質(zhì)的限度是有明確的規(guī)定，一般要求其發(fā)酵生產(chǎn)中產(chǎn)生的A，B，C，D，E，F(xiàn)等異構(gòu)體組分雜質(zhì)含量不高于0.6%，0.5%，1.5%，1.0%，0.2%，0.3%等，同時(shí)，其他組分雜質(zhì)含量均應(yīng)低于0.2%.其中，由于阿卡波糖發(fā)酵生產(chǎn)中，雜質(zhì)組分A與C的分離較為困難，在提高阿卡波糖發(fā)酵生產(chǎn)單位的同時(shí)，需要確保對(duì)其組分雜質(zhì)含量進(jìn)行控制，以保證阿卡波糖發(fā)酵的質(zhì)量。針對(duì)這種情況，通過實(shí)驗(yàn)分析方式對(duì)阿卡波糖產(chǎn)生菌的選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化進(jìn)行分析，以達(dá)到其發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵單位提升、控制雜質(zhì)組分含量的目的。

1 實(shí)驗(yàn)試劑與條件

1.1 儀器與材料

本次實(shí)驗(yàn)所使用阿卡波糖對(duì)照品為浙江省藥品檢驗(yàn)所提供，對(duì)照品純度為99%；實(shí)驗(yàn)中所使用的水為蒸餾水。此外，實(shí)驗(yàn)中所使用的游動(dòng)放線菌（LA-H6）為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，斜面培養(yǎng)基以及種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基的具體培養(yǎng)過程如下。

斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)使用質(zhì)量濃度為30 g/L的淀粉水解液與質(zhì)量濃度為5 g/L的蛋白胨、質(zhì)量濃度為0.5 g/L的K2HPO4·3H2O與MgSO4·7H2O、質(zhì)量濃度為16 g/L的瓊脂，通過消前調(diào)整pH值為7.0進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)；種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)采用質(zhì)量濃度為10 g/L的淀粉與質(zhì)量濃度為20 g/L的甘油、質(zhì)量濃度為20 g/L的黃豆餅粉、質(zhì)量濃度為2 g/L的CaCO3，通過消前調(diào)整pH值為6.8進(jìn)行培養(yǎng)形成；發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)按照質(zhì)量濃度為40 g/L淀粉的水解液、質(zhì)量濃度為30 g/L的葡萄糖、質(zhì)量濃度為5 g/L的黃豆餅粉、質(zhì)量濃度為10 g/L的酵母粉、質(zhì)量濃度為5 g/L的谷氨酸鈉與質(zhì)量濃度為0.1 g/L的FeCl3·6H2O、質(zhì)量濃度為1 g/L的NH4Cl與K2HPO4·3H2O、質(zhì)量濃度為3 g/L的CaCO3，通過消前調(diào)整pH值為6.8進(jìn)行培養(yǎng)形成。

1.2 樣品制備

對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心處理約15 min后，提取上清液，與1 mL水、2 mL乙腈進(jìn)行充分混合后，再進(jìn)行離心處理約15 min，并提取上清液采用微孔濾膜進(jìn)行過濾后，作為試驗(yàn)樣品溶液進(jìn)行備用，同時(shí)精密量取阿卡波糖對(duì)照品后，加入是適量水后制成對(duì)照品溶液，確保對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度為800 μg/mL，以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析使用。

1.3 色譜條件

實(shí)驗(yàn)中，HPLC色譜法按照色譜柱4.6 mm×2.5 mm，5 μm；流動(dòng)相為物質(zhì)的量濃度為0.01 mol/L的磷酸緩沖液-乙腈（其中，磷酸緩沖液pH值為7.0，乙腈為27∶43）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量保持為20 μL，柱溫設(shè)置為35 ℃的條件進(jìn)行檢測(cè)分析。

此外，對(duì)發(fā)酵液中還原糖以及總糖含量測(cè)定，采用3，5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行檢測(cè)分析，具體方法為量取5 mL發(fā)酵液，5 mL的物質(zhì)的量濃度為5 mol/L的鹽酸在沸水中坐浴約15 min完成水解后，進(jìn)行測(cè)量分析。對(duì)氨基氮檢測(cè)采用甲醛法進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 誘變方法

對(duì)UV和亞硝基胍的復(fù)合誘變通過在出發(fā)菌株斜面進(jìn)行菌絲刮取，并裝置在玻璃珠的無菌試管內(nèi)，然后把質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鋰溶液加入，通過振蕩分散制成菌絲懸浮液后，提取5 mL放置在無菌平皿中，采用紫外線照射方式，以30 W、20 cm的照射距離在254 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行照射約2～5 min后，進(jìn)行誘變后的菌絲懸浮液收集，并進(jìn)行離心處理約15 min后傾掉上清液，與1 mL的質(zhì)量濃度為1 mg/mL的亞硝基胍溶液進(jìn)行混合，在0～4 ℃溫度條件下進(jìn)行處理40～60 min，并進(jìn)行離心處理，使用無菌水進(jìn)行洗滌沉淀2次，以進(jìn)行試驗(yàn)分析備用。

進(jìn)行硫酸二乙酯誘變處理，按照將硫酸二乙酯原液使用物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的硫酸緩沖液進(jìn)行配制形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的試驗(yàn)溶液，然后提取5 mL菌絲懸浮液與5 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫酸二乙酯溶液進(jìn)行混合，在28 ℃條件下按照220 r/min速率進(jìn)行振蕩處理40～60 min后，加入0.5 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫代硫酸鈉溶液進(jìn)行終止反應(yīng)，最后經(jīng)離心處理后使用無菌水進(jìn)行洗滌沉淀2次，以進(jìn)行試驗(yàn)分析備用。

亞硝酸誘變處理中，將物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的亞硝酸鈉作為誘變劑，進(jìn)行誘變處理40～60 min后，通過離心處理并使用無菌水進(jìn)行洗滌沉淀2次，用于試驗(yàn)分析備用。

2.2 突變株篩選

根據(jù)上述誘變方式，將進(jìn)行誘變處理后的菌絲懸浮液均勻地涂在分離平板上，在28 ℃溫度條件下培養(yǎng)5～10 d后，以菌落形態(tài)變化較為明顯的突變株與裝有30 mL種子培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行接入，在28 ℃條件下按照220 r/min速率進(jìn)行振蕩后培養(yǎng)2 d，然后按照5%的接種量與裝有150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶進(jìn)行接入，按照260 r/min速率在28 ℃條件中進(jìn)行培養(yǎng)6 d，完成后，即可按照上述HPLC色譜條件進(jìn)行阿卡波糖發(fā)酵單位及其組分含量測(cè)定分析。

需要注意的是，通過上述方法對(duì)出發(fā)菌株游動(dòng)放線菌LA-H6的阿卡波糖發(fā)酵單位進(jìn)行測(cè)量分析顯示高于2 110 μg/mL，并且在對(duì)游動(dòng)放線菌進(jìn)行UV-亞硝基胍復(fù)合誘變與二次篩選處理后，所得到的高產(chǎn)突變株，其阿卡波糖發(fā)酵單位達(dá)到質(zhì)量濃度2 510 μg/ mL以上，同時(shí)，該突變株進(jìn)行阿卡波糖發(fā)酵生產(chǎn)過程中后期會(huì)生成雜質(zhì)組分A與C，并且雜質(zhì)組分A與C的含量較多。根據(jù)這一情況，通過將上述篩選獲取的突變株（即UN-26）作為出發(fā)菌，進(jìn)行誘變分析與篩選處理后，再次獲得阿卡波糖純度較高的突變株，即高產(chǎn)突變株（SIPI-AK），該突變株的阿卡波糖發(fā)酵生產(chǎn)單位達(dá)到質(zhì)量濃度2 850 μg/ mL以上，與游動(dòng)放線菌相比，提升約36%，且在阿卡波糖發(fā)酵生產(chǎn)中雜質(zhì)組分A生成含量非常低，同時(shí)雜質(zhì)組分C含量也明顯降低，降低比率達(dá)到80%左右。

2.3 工藝優(yōu)化

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，以高產(chǎn)突變株（SIPI-AK）作為出發(fā)菌，按照10 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝進(jìn)行試驗(yàn)分析，在以生長(zhǎng)良好的斜面與種子培養(yǎng)基進(jìn)行接種，并按照28 ℃溫度條件下，以220 r/min速度進(jìn)行振蕩培養(yǎng)44～48 h后，提取種子液按照5%的接種量與裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐進(jìn)行接種培養(yǎng)。其中，罐壓設(shè)置在0.07～0.13 MPa范圍內(nèi)，攪拌速率設(shè)定為300～600 r/min，通氣量為300～400 L/h進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，并且在發(fā)酵培養(yǎng)48 h后隔24 h進(jìn)行葡萄糖、麥芽糖以及氨基氮含量檢測(cè)，并結(jié)合檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行流加谷氨酸鈉、葡萄糖、麥芽糖。

結(jié)果顯示，在發(fā)酵周期為8 d情況下，在流加谷氨酸鈉且氨基氮維持在質(zhì)量濃度為0.14 mg/mL和0.18 mg/mL的發(fā)酵罐中，其阿卡波糖發(fā)酵單位無明顯差異。而在流加谷氨酸鈉且氨基氮維持在質(zhì)量濃度為0.14 mg/mL的發(fā)酵罐中，其阿卡波糖發(fā)酵生產(chǎn)雜質(zhì)組分C含量最低。

圖1為阿卡波糖產(chǎn)生菌選育、發(fā)酵生產(chǎn)中，對(duì)補(bǔ)料添加不同氮源的影響分析結(jié)果。根據(jù)該結(jié)果可以看出，補(bǔ)料中添加谷氨酸鈉效果最明顯，因此，上述在對(duì)其工藝優(yōu)化分析中采用流加谷氨酸鈉。

圖1 阿卡波糖選育發(fā)酵中補(bǔ)料添加不同氮源的影響結(jié)果

3 結(jié)束語

綜上所述，對(duì)阿卡波糖產(chǎn)生菌的選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化進(jìn)行研究，有利于為阿卡波糖選育與發(fā)酵實(shí)踐提供參考，促進(jìn)其發(fā)酵生產(chǎn)質(zhì)量和效果提升，具有較大的作用和意義。

［1］梅建鳳，蔡少芬，李靚，等.高產(chǎn)舍雷肽酶的粘質(zhì)沙雷氏菌誘變選育［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)2018（02）：1-7.

［2］龍尾，湯衛(wèi)華，呂春暉，等.L-絲氨酸產(chǎn)生菌的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究［J］.科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2017（10）：77.

2095－6835（2018）18－0134－02

TQ463.2

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2018.18.134

〔編輯：張思楠〕