劉 棣，張寅斌，宋玲琴，閆婉君，趙小瑤，盛倩文，許 朋，張淑群

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，西安 710004)

氟尿嘧啶是臨床最常用的胃癌化療藥物，通過干擾腫瘤細胞DNA合成而發(fā)揮抗癌作用。胃癌是常見的惡性腫瘤，在東亞國家發(fā)病率較高。胃癌的發(fā)生是多個癌基因、抑癌基因共同作用的結(jié)果。胃癌是預(yù)后較差的消化道腫瘤之一。胃癌治療失敗的主要原因是化療耐藥性的產(chǎn)生[1]。研究顯示，腫瘤細胞可抑制活化5-Fu所需的關(guān)鍵酶，增強5-Fu代謝酶的活性，降解胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)還原性葉酸底物，TS活性變化，這些機制都會產(chǎn)生對抗5-Fu的作用。隨著對微小RNA(microRNA，miRNA)認識的不斷深入，近年來對胃癌化療耐藥性的研究轉(zhuǎn)向了miRNA。它是非編碼的單鏈小RNA，通常含有18～25個核苷酸序列[2]，miRNA廣泛存在于生物體內(nèi)，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，作用于靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)參與生物學(xué)過程調(diào)控，在人類發(fā)育、腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c 3個成員組成，研究表明，miR-34a在多種腫瘤中異常表達，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。筆者研究了miRNA-34a在胃癌腫瘤細胞中對5-Fu化療敏感性的影響，探討5-Fu在胃癌細胞中的耐藥機制。

1 資料與材料

1.1一般資料 選取2013年12月～2015年12月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院診斷為胃癌并接受手術(shù)治療的5例患者手術(shù)后標本，男4例，女1例，平均年齡58歲。分別對胃癌組織和癌旁組織進行取材。

1.2材料與試劑 人胃癌細胞株SGC7901，GC823，MGC803，KATOⅢ 和MKN45人胃黏膜細胞GES-1(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心)。采用RPMI 1640和DMEM培養(yǎng)基采購培養(yǎng)細胞(Hyclone公司)；以miRNA mimics、miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染腫瘤細胞(Dharmacon公司，引物由北京華大基因公司合成)；RT-PCR相關(guān)試劑(TAKARA公司)；5-Fu(美國Sigma公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 選取人胃癌細胞BGC823、MGC803、SGC7901、KATOⅢ和MKN 45及人胃黏膜細胞株GES-1培養(yǎng)在含10%小牛血清的DMEM中。取細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板(2.5×105·孔-1)。采用miR-34a mimic，negative control瞬時轉(zhuǎn)染KATOⅢ細胞株。以無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌，加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2胃癌細胞組織RNA提取 將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板，加入Trizol裂解液，移液器混勻。組織置于液氮中，研磨成碎片，按照比例加入Trizol 100 mg和組織1 mL，轉(zhuǎn)入勻漿儀處理。加入氯仿，振蕩15 s。按protocol離心15 min，水相轉(zhuǎn)移到新管中，采用異丙嗪沉淀水相中的RNA，離心10 min，棄上清液，用體積分數(shù)為75%的乙醇洗滌RNA沉淀，真空抽干RNA沉淀，加入無Rnase水200 μL，60 ℃放置10 min，標本于-80 ℃保存，備用。

2.3RT-PCR檢測 采用Trizol法處理提取RNA，標本于-80 ℃保存，用紫外分光光度法測定RNA濃度，波長為260～280 nm，吸光度值A(chǔ)為1.7～2.2。瞬時轉(zhuǎn)染后，通過定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-34a表達量的變化。采用TaKaRa試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。產(chǎn)物于4 ℃保存，加入到下一步的real time PCR反應(yīng)。定量PCR采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行RT-PCR。95C預(yù)變性5 min，95C變性 10 s，60C退火 20 s，72C延伸 20 s，78C 20 s，共40個循環(huán)，重復(fù)3次，收集反應(yīng)數(shù)據(jù)。U6 snRNA作為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計算miR-34a的表達水平。

2.4四唑鹽比色法(MTT)檢查藥物濃度反應(yīng) 取對數(shù)期KATOⅢ細胞轉(zhuǎn)入96孔細胞培養(yǎng)板中(200 μL·孔-1)培養(yǎng)，每孔104個細胞，24 h后轉(zhuǎn)染。設(shè)置5-Fu濃度梯度：0，5，10，20，40和80 μmol·L-1等比稀釋后加入96孔板。在48 h后加入四唑鹽(MTT)10 μL，進行MTT檢測，孵育4 h后，取上清液，加入DMSO，振蕩10 min，酶標儀于490 nm處檢測吸光度值。計算IC50值。

2.5四唑鹽比色法(MTT)檢查細胞增殖 取對數(shù)期KATOⅢ細胞轉(zhuǎn)入96孔細胞培養(yǎng)板中(200 μL·孔-1)培養(yǎng)24 h后，采用miR-34a mimic，negative control瞬時轉(zhuǎn)染后，分別于轉(zhuǎn)染后24，48和72 h對miR-34a mimic組和negative control組進行MTT檢測。

2.6統(tǒng)計學(xué)處理 以SPSS 17.0統(tǒng)計軟件完成。miR-34a的表達量、增殖率的比較采用t檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1胃癌細胞株中miR-34a的表達 定量PCR檢測各胃癌細胞株miR-34a表達水平，以胃黏膜細胞GES-1為參照，miR-34a相對表達量為1，對各胃癌細胞中miR-34a的表達量進行對比。結(jié)果顯示，胃癌細胞BGC823、KATOⅢ、MGC803、MKN45和SGC7901中miR-34a的表達均低于胃黏膜細胞GES-1的表達水平(P<0.05)，分別為0.223 75±0.015，0.248±0.025，0.34±0.041，0.302±0.035和0.386±0.032。

3.2胃癌組織中miR-34a的表達 通過定量PCR檢測各胃癌組織及鄰近正常組織miR-34a表達水平，對比胃癌組織中miR-34a的表達。實驗結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-34a的表達均低于鄰近胃正常組織的表達水平(P<0.05)，見表1。

表1胃癌組織中miR-34a的表達情況

Tab.1 The expression of miR-34a in gastric cancer tissue

患者編號正常組織(N)腫瘤組織(T)PT10.938 7±0.0120.343±0.042*PT21.145±0.1050.352±0.048*PT30.855±0.030.545 5±0.035*PT41.103 5±0.0650.648±0.049*PT50.751±0.0610.628±0.052 6*

注：與正常組織(N)比較*P<0.05。

3.3miR-34a增加腫瘤細胞對5-Fu的敏感性 本研究選取的胃癌細胞BGC823、KATOⅢ、MGC803、MKN45和SGC7901中miR-34a均處于低表達狀態(tài)，選取惡性程度較高的KATOⅢ進一步研究miR-34a對5-Fu敏感性的影響。在KATOⅢ 細胞中，上調(diào)miR-34a表達后按濃度梯度加入化療藥物5-Fu。藥物作用48 h后，MTT法檢測各組細胞吸光度值A(chǔ)，藥物濃度反應(yīng)曲線顯示，與negative control(NC)組比較，miR-34a mimics組IC50值下降(P<0.05)。上調(diào)miR-34a后，KATOⅢ 細胞對5-Fu敏感性增加。見圖1。

圖1miR-34a對KATOⅢ細胞5-Fu(mol·L-1)敏感性的影響(*P<0.05)

Fig.1 The influence of miR-34a on sensitivity of 5-Fu (mol·L-1) in KATOⅢ cells (*P<0.05)

3.4miR-34a抑制KATOⅢ細胞增殖 轉(zhuǎn)染后，檢測各組細胞增殖情況，miR-34a mimics組與control組相比較，miR-34a組對腫瘤細胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.05)，見圖2。

圖2miR-34a對細胞增殖的影響(*P<0.05)

Fig.2 The influence of miR-34a onKATOⅢ cell proliferation (*P<0.05)

4 討論

胃癌對5-Fu的耐藥性一直備受關(guān)注，腫瘤的耐藥機制較復(fù)雜，涉及多個基因和過程，是多個因素共同作用的結(jié)果[4]。研究顯示，耐藥相關(guān)基因異常表達，會使抗腫瘤藥物濃度下降，影響藥物的療效[5-7]。近年來，有研究顯示，miRNAs也通過多種途徑直接或間接地參與調(diào)控腫瘤的耐藥性和敏感性[8-14]。通過miRNAs來影響腫瘤對藥物的敏感性成為可能[15-18]。

研究表明，一些miRNAs可能增加腫瘤化療的耐藥性[19]。一項入組1 299例乳腺癌相關(guān)miRNA研究中發(fā)現(xiàn)，miR-105和miR-93-3p在乳腺癌中處于高表達狀態(tài)，且與三陰性乳腺癌較差的預(yù)后密切相關(guān)，其機制可能是miR-105和miR-93-3p通過下調(diào)SFPR1，從而激活癌細胞Wnt/β-catenin通路活性，促進三陰性乳腺癌細胞的干細胞性，增加化療耐藥性，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[20]。相反，有一些miRNAs被認為可以增加腫瘤化療敏感性。胰腺癌常對化療藥物耐藥，研究表明，miR-429在吉西他濱耐藥細胞株SW1990/GZ中低表達，而上調(diào)miR-429的表達后，PDCD4的表達也上調(diào)，而SW1990/GZ細胞對吉西他濱的敏感性，體外的PDCD4敲除實驗和動物體內(nèi)研究表明，miR-429通過調(diào)控胰腺癌細胞中的PDCD4，來增加胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性[21]。Kim C H等[1]在胃癌中做了耐藥性相關(guān)miRNAs的研究，發(fā)現(xiàn)上調(diào)let-7、miR-342和miR-16等的表達，可調(diào)控腫瘤細胞的凋亡，增加化療敏感性。而一些與鉑類、氟尿嘧啶耐藥相關(guān)的miRNAs與疾病進展時間密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a無論是在胃癌細胞還是在胃癌組織中都處于低表達狀態(tài)。其中在胃癌細胞KATOⅢ中同樣處于較低表達狀態(tài)，依此推斷miR-34a在胃癌中發(fā)揮抑癌作用。在分化較差的KATOⅢ細胞中上調(diào)了miR-34a的表達，檢測胃癌細胞發(fā)現(xiàn)，癌細胞對化療藥物的敏感性增加。KATOⅢ細胞株被認為是P53突變、表達缺失的細胞株，上調(diào)miR-34a的表達后，細胞的增殖被抑制，提示這可能恢復(fù)了P53的功能，腫瘤細胞因此表現(xiàn)為對化療藥物更為敏感。依此推測miR-34a在胃癌細胞中的這種調(diào)控機制可能與其下游的Notch和Bcl-2等基因相關(guān)，它可能參與了胃癌腫瘤干細胞的自我更新和分化，這一推測還有待后續(xù)的研究進一步證實。

藥物耐藥性和敏感性一直都是研究中的難點問題[22-26]。5-Fu作為消化道腫瘤基礎(chǔ)的化療藥物，在臨床中廣泛應(yīng)用，本研究以miRNAs為著眼點，探索研究了5-Fu在胃癌治療中敏感性的可能機制，結(jié)果表明，5-Fu的化療敏感性受miR-34a的調(diào)控，被認為是其調(diào)控機制之一，可能在胃癌的化療中發(fā)揮重要作用，為今后的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。