張國(guó)蘭，馬瑞娟，閔云燕

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，河南省兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院，鄭州 450018)

氫氯噻嗪(6-氯-3，4-二氫-2H-1，2，4-苯并噻二嗪-7-磺酰胺-1，1-二氧化物，HCT)為噻嗪類利尿藥，具有利尿、降壓作用，屬于苯并噻唑類化合物，是一種無臭無味的白色結(jié)晶粉末，微溶于水，溶于甲醇。它通過減少腎小管中電解質(zhì)的再吸收，造成鈉離子和氯離子排泄的增加，從而導(dǎo)致水的排泄增加。氫氯噻嗪能增加鎂離子、鉀離子排泄，減少鈣離子排泄。

已有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法[1-6]、高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法[7-16]和毛細(xì)管電泳法[17-19]等不同檢測(cè)技術(shù)的方法用于測(cè)定復(fù)方降壓藥中氫氯噻嗪的含量以及單獨(dú)服用氫氯噻嗪或與其他藥物、生物液體合用時(shí)的質(zhì)量濃度。然而這些檢測(cè)方法需要復(fù)雜的儀器設(shè)備、靈敏度較低、耗時(shí)較長(zhǎng)，因此開發(fā)一種簡(jiǎn)便快速的氫氯噻嗪測(cè)定方法十分重要。

筆者建立了一種準(zhǔn)確、靈敏的用于測(cè)定人血漿中氫氯噻嗪質(zhì)量濃度的HPLC法，并對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法也成功地應(yīng)用于氫氯噻嗪片的中國(guó)人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫公司)，配備了G1379A在線真空脫氣機(jī)、G1311A四元輸液泵、G1316A柱溫箱、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器及G1315B二極管陣列檢測(cè)器。

1.2試藥 氫氯噻嗪(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%，批號(hào)LOT50183243)，氟康唑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%，批號(hào)LOT3968F450)，均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。乙腈(色譜純)、三氟乙酸(色譜純)、乙酸乙酯、正己烷和磷酸二氫鈉，均購(gòu)于百靈威公司。超純水(電阻>18 mΩ)，用美國(guó)密理博公司的Milli-Q純化系統(tǒng)制備。

2 方法

2.1樣品的制備

2.1.1對(duì)照品和質(zhì)控樣品 氫氯噻嗪儲(chǔ)備液(100.0 μg·mL-1)和氟康唑儲(chǔ)備液(IS，10.0 μg·mL-1)用甲醇稀釋制得。用于校準(zhǔn)和質(zhì)量控制的工作液用甲醇稀釋儲(chǔ)備液制得。所有配制好的溶液均保存于4 ℃的冰箱中。

氫氯噻嗪對(duì)照品系列溶液分別由人空白血漿加入適量的工作溶液制得，最終制得氫氯噻嗪對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度分別為5，10，25，50，100，200，300和400 μg·mL-1。質(zhì)控(QC)樣品使用同樣的方法進(jìn)行制備，其質(zhì)量濃度分別為10，80和320 μg·mL-1。

2.1.2血漿樣品制備 向10 mL的EP管中加入500 μL血漿樣本和50 μL的內(nèi)標(biāo)氟康唑溶液(300 ng·mL-1)，混合1 min，然后加入500 μL質(zhì)量濃度為50 g·L-1的磷酸二氫鈉溶液，4 mL的乙酸乙酯和1 mL的正己烷。渦旋混合2 min后以13 000 r·min-1離心10 min，上層清液被分離收集并在37 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?。殘留物加?00 μL的流動(dòng)相，渦旋混合3 min使其重新溶解，以13 000 r·min-1離心10 min，取20，40，60，80和100 μL等20 μL的整數(shù)倍進(jìn)樣量進(jìn)樣分析。

2.2色譜條件 色譜柱采用 AgilentZOR-BAX Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，帶有保護(hù)柱XDB-C18protection 色譜柱(12.5 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相使用乙腈∶1 mL·L-1三氟乙酸∶水=20∶40∶40；檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm；流速：0.8 mL·min-1。

2.3方法驗(yàn)證 通過分別測(cè)定空白血漿樣品和加入了氫氯噻嗪、內(nèi)標(biāo)氟康唑的血漿樣品來評(píng)估該方法的選擇性。校正曲線通過連續(xù)3 d分析加標(biāo)校準(zhǔn)樣品進(jìn)行驗(yàn)證。以血漿中待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)，用加權(quán)最小二乘法(W=1/x2)進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得回歸方程，氫氯噻嗪的線性范圍為5～400 ng·mL-1。選擇血漿中氫氯噻嗪的定量下限(LLOQ)作為校準(zhǔn)曲線中使用的最低質(zhì)量濃度。

2.3.1準(zhǔn)確度和精密度 通過測(cè)定10，80和320 ng·mL-13個(gè)質(zhì)量濃度水平質(zhì)控樣品來評(píng)估方法的準(zhǔn)確度和精密度。方法的精密度用RSD值表示，準(zhǔn)確度用相對(duì)誤差(RE)表示。

測(cè)定血漿樣品中氫氯噻嗪的峰面積與樣品萃取前的峰面積，與萃取后添加氫氯噻嗪溶液的血漿樣品的峰面積進(jìn)行比較，測(cè)定氫氯噻嗪在3個(gè)質(zhì)控質(zhì)量濃度水平(n=6)下的萃取回收率。以類似的方法測(cè)定內(nèi)標(biāo)氟康唑(300 ng·mL-1)的萃取回收率。

2.3.2方法穩(wěn)定性 在不同條件下，重復(fù)5次分析3種質(zhì)量濃度(10，80和320 ng·mL-1)水平的血漿樣品來測(cè)試人血漿中氫氯噻嗪的穩(wěn)定性。分別測(cè)定在室溫下存放4 h的加標(biāo)樣品、在4 ℃條件下在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置了24 h準(zhǔn)備測(cè)定的萃取后的樣品，確定該方法的短期穩(wěn)定性。測(cè)定連續(xù)3 d 在-20 ℃條件下3次完全凍融循環(huán)后的樣品，評(píng)估凍融穩(wěn)定性。測(cè)定在-20 ℃條件下儲(chǔ)存28 d后的加標(biāo)血漿樣品，評(píng)估該測(cè)定方法的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

2.4藥代動(dòng)力學(xué)研究 實(shí)驗(yàn)方案在本研究工作開展前得到了鄭州兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)(批件號(hào)ICE-C-004-A06-V1.0)。按照赫爾辛基宣言的原則，選取20名男性健康志愿者，平均年齡26.5±3.1歲，體質(zhì)量66.2±5.8 kg，志愿者均簽署知情同意書，同意參加該臨床研究。在研究工作開展前對(duì)提交了參與本項(xiàng)目協(xié)議的志愿者進(jìn)行了血常規(guī)、尿常規(guī)、心電圖、肝腎功能、血壓和血糖等項(xiàng)目的檢查，志愿者各項(xiàng)檢查指標(biāo)均正常。志愿者在開始測(cè)試的前7 d內(nèi)未服用其他任何藥物，同時(shí)要求志愿者在研究工作開始前24 h禁煙禁酒，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。所有志愿者都用200 mL的水口服了劑量50 mg的氫氯噻嗪片。分別在口服給藥后的0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，12，24和36 h經(jīng)肘靜脈采集血樣(3 mL)到預(yù)先添加了抗凝劑(肝素)試管中，將血液樣品以6 000 r·min-1離心10 min，分離血漿并在-20 ℃下冷凍，備用。

3 結(jié)果與討論

3.1方法的開發(fā) 為了獲得更好的色譜峰形狀，在可接受的保留時(shí)間和分辨率前提下，嘗試了幾種不同的溶劑配比優(yōu)化流動(dòng)相的組分。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在乙腈∶1 mL·L-1三氟乙酸∶水(20∶40∶40)的流動(dòng)相配比條件下，在很短的時(shí)間內(nèi)就夠獲得良好分離效果[20]。在內(nèi)標(biāo)物的選擇中，優(yōu)先使用氟康唑，沒有采用伊曲康唑和酮康唑，是因?yàn)樵谕瑯拥纳V條件下，使用氟康唑作為內(nèi)標(biāo)可縮短整個(gè)分析過程的時(shí)間，在實(shí)驗(yàn)中的洗脫條件下，氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)氟康唑的色譜峰均能被很好的分離，且沒有其他內(nèi)源物質(zhì)的干擾。

3.2靈敏度 在上述實(shí)驗(yàn)條件下，氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)氟康唑與其他內(nèi)源性物質(zhì)均有良好的分離效果?？瞻籽獫{樣品、加入氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)氟康唑的血漿樣品以及志愿者血漿樣品的代表性色譜圖見圖1。在6個(gè)隨機(jī)選擇的人血漿樣品的色譜圖中，氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)氟康唑的保留時(shí)間分別為4.2和5.5 min，且都沒有其他物質(zhì)的干擾色譜峰出現(xiàn)，每個(gè)樣品的總運(yùn)行時(shí)間為6.0 min。

圖1HPLC圖

A.空白血漿樣品；B.加入氫氯噻嗪(100 ng·mL-1)和氟康唑(300 ng·mL-1)的血漿樣品；C.志愿者血漿樣品；1.氫氯噻嗪；2.氟康唑。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.blank plasma sample；B.blank plasma sample spiked with HCT (100 ng·mL-1) and fluconazole(300 ng·mL-1)；C.plasma sample of the volunteers；1.hydrochlorothiazide；2.fluconazole.

3.3校準(zhǔn)曲線的線性 在血漿中的氫氯噻嗪5～400 ng·mL-1的范圍內(nèi)進(jìn)行了峰面積比值與質(zhì)量濃度的線性回歸擬合。校準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=414.894 8x-0.842 3，r=0.999 9，其中y表示氫氯噻嗪與內(nèi)標(biāo)氟康唑峰面積的比值，x表示血藥質(zhì)量濃度。用于血漿中氫氯噻嗪測(cè)定的定量下限(LLOQ)為5 ng·mL-1。定量下限的精密度和準(zhǔn)確度分別為8.5%和9.1%。

3.4精密度和準(zhǔn)確度 用3個(gè)質(zhì)量濃度水平(10，80和320 ng·mL-1)計(jì)算3 d的質(zhì)控樣品的RSD值，評(píng)估該方法的精密度。質(zhì)控樣品3個(gè)質(zhì)量濃度的氫氯噻嗪的日內(nèi)RSD值在7.7%以下，日間RSD值在8.9%以下。氫氯噻嗪在質(zhì)控樣品3個(gè)質(zhì)量濃度的相對(duì)誤差范圍為-7.1%～7.9%，結(jié)果表明，該方法的精密度和準(zhǔn)確度均在可接受范圍內(nèi)。

3.5回收率 在10，80和320 ng·mL-1的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度下，氫氯噻嗪的平均回收率分別為85.8%±5.4%，80.6%±5.0%和84.1%±4.4%(n=6)。內(nèi)標(biāo)氟康唑的回收率為82.7%±4.3%，見表1。

表1萃取后人血漿中氫氯噻嗪和氟康唑的回收率

Tab.1 Recovery rate test of HCT and fluconazole from human plasma after extraction

(n=6)

3.6穩(wěn)定性 在室溫條件下，加入氫氯噻嗪的3個(gè)質(zhì)控血漿樣品(10，80和320 ng·mL-1)，在3個(gè)凍融循環(huán)期的RSD值范圍為5.1%～8.6%，相對(duì)誤差范圍為-5.8%～8.4%，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；在-20 ℃下儲(chǔ)存28 d的RSD值范圍為4.9%～7.2%，相對(duì)誤差范圍為-7.1%～-5.0%，也同樣表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；我們對(duì)萃取后在4 ℃條件下儲(chǔ)存至少24 h的樣品進(jìn)行了測(cè)定，該方法均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

3.7該方法的實(shí)際應(yīng)用 上述測(cè)定方法已通過了鄭州兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)倫理批準(zhǔn)，成功應(yīng)用于測(cè)定人血漿中氫氯噻嗪的質(zhì)量濃度。在20名志愿者口服50 mg 氫氯噻嗪片后，對(duì)氫氯噻嗪的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了計(jì)算評(píng)估。氫氯噻嗪的平均血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線見圖2，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果見表2。

圖220名志愿者單次口服50mg氫氯噻嗪后的平均血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線

Fig.2 Mean plasma concentration-time profiles of hydrochlorothiazide after a single oral administration of 50 mg HCT to 20 Chinese healthy male volunteers

表2氫氯噻嗪的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果

Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of hydrochlorothiazide

參數(shù)數(shù)值半衰期 t1/2/h11.70±1.60最大血藥質(zhì)量濃度Cmax/ng·mL-1275.33±38.30達(dá)峰時(shí)間tmax/h2.25±0.34藥時(shí)曲線下面積AUC0→36/ng·mL-1·h2 295.75±219.15藥時(shí)曲線下面積 AUC0→∞/ng·mL-1·h2 546.99±229.78

4 結(jié)論

本研究前期通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選，建立并驗(yàn)證了一種以氟康唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)的血漿中氫氯噻嗪質(zhì)量濃度的HPLC法，氫氯噻嗪質(zhì)量濃度在5～400 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)氟康唑在單一洗脫模式下可獲得很好的色譜分離效果，且在各自的色譜峰位置無其他內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，在7 min內(nèi)可完成一次完整的分析。該方法選擇性好、靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、快速，適用于臨床口服氫氯噻嗪的藥代動(dòng)力學(xué)研究。