皮鳳娟，黃 娟，張慶蓮，張世波，趙 領(lǐng)，劉 浩

(1.瀘州市中醫(yī)醫(yī)院，瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，瀘州 646000)

硝礬洗劑是瀘州市中醫(yī)醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱我院)的臨床協(xié)定方，是我院肛腸科根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)用藥組方而成。該制劑處方由大黃、黃柏和蒼術(shù)等組成，具有清熱解毒、消腫止痛和收濕止癢的作用[1-2]，臨床主治痔瘡，已使用多年，療效顯著、不良反應(yīng)小、安全可靠。但其中藥成分復(fù)雜、藥效各異，對(duì)本復(fù)方的整體提取不能只參照文獻(xiàn)中單味藥材的提取方法。為進(jìn)一步開發(fā)本復(fù)方制劑，本文立足于中藥復(fù)方的整體性，在保留傳統(tǒng)中藥湯劑特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，以君藥大黃中的總蒽醌含量和干浸膏得率為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)其制備工藝進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)院內(nèi)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 戴安高效液相色譜儀，包括四元泵、紫外檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器等(美國戴安公司)；FA2004型電子天平(上海安亭電子儀器廠)。

1.2試藥 大黃酸對(duì)照品，大黃素對(duì)照品，大黃素甲醚對(duì)照品，蘆薈大黃素對(duì)照品以及大黃酚對(duì)照品(批號(hào)分別為110757-200206，110756-200110，110758-201013，110795-201007和110796-201017)，均購自中國食品藥品檢定研究院；大黃(批號(hào)150623)、黃柏(批號(hào)15060102)、蒼術(shù)(批號(hào)150325)和白礬(批號(hào)150612)藥材，均由瀘州天植中藥飲片有限公司提供；冰片(批號(hào)130309)，由四川青神康華制藥有限公司提供；芒硝(批號(hào)D1312034)，由四川新荷花中藥飲片股份有限公司提供；甲醇為色譜純；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1提取時(shí)間考察 按照處方量的1/3準(zhǔn)確稱取藥材(大黃，黃柏和蒼術(shù))各4份，固定提取次數(shù)為3次，加水倍量為10倍，依次提取0.25，0.5，1和2 h，綜合評(píng)分分別為60.10，80.36，95.54和99.09。結(jié)果表明，提取2 h的分?jǐn)?shù)最高，但提取1 h的總蒽醌含量比2 h高，且提取2 h耗能多，故選擇提取時(shí)間為1 h[3-5]。

2.1.2提取次數(shù)考察 按照處方量的1/3準(zhǔn)確稱取藥材(大黃，黃柏和蒼術(shù))各3份，固定提取時(shí)間為1 h，加水倍量為10倍，依次提取1，2和3次，綜合評(píng)分分別為54.63，84.86和99.96。從綜合評(píng)分來看，提取3次的分?jǐn)?shù)最高且與其他2個(gè)相差較大，故選擇提取次數(shù)為3次。

2.1.3加水倍數(shù)考察 按照處方量的1/3準(zhǔn)確稱取藥材(大黃，黃柏和蒼術(shù))各3份，固定提取時(shí)間為1 h，提取次數(shù)為3次，依次加水10，15和20倍量，綜合評(píng)分分別為87.89，92.87和100.00。結(jié)果表明，當(dāng)加水倍量為20倍時(shí)，綜合評(píng)分最高，故選擇加水倍量為20倍。

2.2正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到劑型為洗劑，故最終選定加水倍量、提取時(shí)間和提取次數(shù)作為正交實(shí)驗(yàn)的考察因素，將總蒽醌含量和干浸膏得率作為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定，應(yīng)用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)以減少偶然誤差[6]。因素與水平見表1。按照L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，按照處方量的1/3準(zhǔn)確稱取藥材(大黃，黃柏和蒼術(shù))，共27份，編為1～27號(hào)(每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。每份55 g(其中大黃25 g，黃柏15 g，蒼術(shù)15 g)，分別置于圓底燒瓶中，加入純化水，按照表1因素進(jìn)行提取，提取液過濾，冷卻，定容即得。

2.3干浸膏得率的測(cè)定 精密移取2.2項(xiàng)下制備的提取液50～100 mL，置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，再置于105 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算干浸膏得率，結(jié)果見表2。

表1水提工藝因素與水平

Tab.1 Factors and levels of the water extracting technology

水平因素A,加水量/倍B,提取次數(shù)/次C,提取時(shí)間/minD,空白118140-220260-322380-

注：-表示空白列，用于計(jì)算偶然誤差。

2.4提取液中5種蒽醌的含量測(cè)定

2.4.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：1 mL·L-1磷酸∶甲醇(15∶85)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃[7-9]。色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference sample；B.sample；C.negative sample；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion.

表2水提工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Orthogonal test results of water extraction process

實(shí)驗(yàn)號(hào) ABCD干浸膏收率/%總蒽醌含量/mg·g-1綜合評(píng)分1111116.594.1247.872122228.358.9894.623133331.968.6897.214212320.005.1058.615223130.778.9697.556231228.397.9387.817313220.555.8564.258321325.607.5681.869332131.039.1098.81K1239.70170.73217.54244.23K2243.97274.03252.04246.67K3244.92283.83259.01237.69R1.7437.7013.822.99

注：權(quán)重系數(shù)由大黃總蒽醌含量×60%、干浸膏收率×40%來進(jìn)行綜合評(píng)分。

2.4.2混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mL中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為20.72，24.52，21.56，22.80和11.12 μg·mL-1的溶液[10-11]。

2.4.3供試品溶液的制備 精密稱取2.3項(xiàng)下制備的干浸膏0.25 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，精密稱定，回流60 min后再次稱定，若質(zhì)量減少，則用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液5 mL，置于具塞錐形瓶中，水浴蒸干，加入220 mL·L-1鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加入10 mL氯仿，搖勻后回流60 min，取出，放冷。分取氯仿層，酸液用氯仿提取3次，每次10 mL，合并氯仿液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL量瓶中，過濾，即得[12-14]。

2.4.4陰性樣品溶液的制備 精密稱取缺大黃的陰性干浸膏0.25 g，按照2.4.3項(xiàng)下方法進(jìn)行制備。

2.4.5線性范圍考察 在2.4.1項(xiàng)色譜條件下，分別取混合對(duì)照品溶液1，2，4，8，10，16和20 μL，測(cè)定不同進(jìn)樣量下總蒽醌的峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=7.249 5x+0.429 9(r=0.999 9)，結(jié)果表明，當(dāng)總蒽醌進(jìn)樣量在72～1 440 μg范圍時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.4.3項(xiàng)下制備的供試品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為0.29%，0.30%，0.32%，0.33%和0.35%，表明該方法精密度良好。

2.4.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取2.4.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，在0，2，4，6和8 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算其RSD值分別為0.46%，0.57%，0.70%，1.06%和1.49%，結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚均在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品6份，按照2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.4.1項(xiàng)下色譜條件平行操作測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的RSD值均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取同一批樣品5 mL，6份，分別置于具塞錐形瓶中，每份均精密加入質(zhì)量濃度分別為0.100 2，0.105 0，0.104 6，0.115 8和0.052 8 mg·mL-1的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚以及大黃素甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備液9，8，3.5，7 和6 mL。按照2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照2.4.1項(xiàng)下色譜條件平行操作測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果RSD值均小于3%，表明加樣回收率好。見表3。

表3回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 The results of recovery tests

編號(hào)供試品含量/mg加入對(duì)照品量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均值/%RSD/%13.493 53.235 36.619 296.6199.451.6823.493 53.235 36.749 0100.6233.493 53.235 36.681 498.5343.493 53.235 36.742 1100.4153.493 53.235 36.764 2101.0963.493 53.235 36.710 499.43

2.4.10樣品的含量測(cè)定 分別精密吸取2.4.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液和2.4.3項(xiàng)下制備的供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中大黃總蒽醌的含量，結(jié)果見表4。

2.5方差分析結(jié)果 由表4可知，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要性為B>C>A。方差分析結(jié)果表明，加水量A對(duì)總蒽醌含量和干浸膏得率影響不顯著(P>0.05)，提取次數(shù)B和提取時(shí)間C對(duì)總蒽醌含量和干浸膏得率影響均具有顯著性(P<0.01)。故最佳工藝條件為A1B3C2，即加18倍量水，煎煮3次，每次1 h。

表4正交實(shí)驗(yàn)方差分析

Tab.4 Mean standard deviation analysis of the orthogonal experiment

因素離差平方和SS自由度f均方MSF顯著性A5.1722.583.23B2 617.6421 308.821 638.30**C328.652164.32205.69**D (誤差e)14.38180.80

注：F0.01(2.18)=5.85；F0.05(2，18)=3.49，**P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由于正交實(shí)驗(yàn)中9號(hào)實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)分最高且含量最高，故做1次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[15-17]。考慮到大生產(chǎn)濃縮液耗能較多，且加水量無顯著性影響，再做4個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3次:加水量15倍，提取3次，每次1 h和加水量10倍，提取3次，每次1 h。從驗(yàn)證結(jié)果來看，加水量22倍(9號(hào)實(shí)驗(yàn))含量較高，18倍，15倍和10倍的含量差別不大，但3次提取22倍量水比10倍量水多，濃縮時(shí)耗能較大，且多出的含量有限，從大生產(chǎn)節(jié)約能耗考慮，最終選擇的最佳工藝條件為：加水量10倍，提取3次，每次1 h。

3 討論

大黃為本制劑的君藥，故大黃總蒽醌為本洗劑的主要藥理活性成分[17-19]，結(jié)合相關(guān)研究資料，蒽醌既能溶于沸水也可溶于有機(jī)試劑，但考慮到本制劑為洗劑，故采用水煎煮提取，這樣既保留了傳統(tǒng)中藥物質(zhì)作用基礎(chǔ)，同時(shí)也避免了有機(jī)試劑的污染。

本實(shí)驗(yàn)將單因素實(shí)驗(yàn)法與正交實(shí)驗(yàn)法相結(jié)合，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定正交實(shí)驗(yàn)的方案，對(duì)影響制劑質(zhì)量的主要因素包括加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)等進(jìn)行了系統(tǒng)考察，以干浸膏得率和大黃總蒽醌含量的綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝。從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)是主要影響因素，加水量影響不顯著。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合工業(yè)化大生產(chǎn)，從降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率方面考慮，最終將提取工藝確定為：加水量為10倍量，煎煮時(shí)間為1 h，煎煮次數(shù)為3次。