韓海霞，朱金芳，王 娟，蔣惠娣

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.浙江大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310058)

兩色金雞菊為菊科(Compositae)金雞菊屬植物兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)的干燥頭狀花序，以新疆南疆的和田地區(qū)為其主要生產(chǎn)區(qū)?！缎氯A本草綱要》記載：兩色金雞菊，味甘、性平，歸肝、大腸經(jīng)，功效清熱解毒、化濕止痢[1-2]?，F(xiàn)代藥效學(xué)研究表明，兩色金雞菊提取物具有降血壓[3]、降血脂[4]、抗炎[5]、降血糖[6]和心肌保護[7]等作用，其化學(xué)成分主要以黃酮類化合物為主[8-9]，本研究已從中分離鑒定出馬里苷(CCT-1)、異奧卡寧-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CCT-2)和花旗松素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CCT-3)等黃酮苷類物質(zhì)[10]，結(jié)構(gòu)見圖1。

很多黃酮苷類物質(zhì)可被胃腸道菌群中的酶水解代謝生成苷元，并發(fā)揮藥理作用[11-12]，也是導(dǎo)致某些黃酮類物質(zhì)的吸收和生物利用度低的重要原因[13]。但這些代謝酶在胃腸道各段組織中分布不同，具有底物選擇性，所以糖種類、苷元類型和糖苷鍵的位置在很大程度上導(dǎo)致黃酮苷代謝的差異[14-15]。兩色金雞菊提取物中3個黃酮苷CCT-1、CCT-2和CCT-3含量依次為18.3%，7.6%和1.8%，且均被證明具有顯著抗氧化活性[16]，CCT-1還被證明是兩色金雞菊防治糖尿病的重要成分[17-18]。本文建立此3種黃酮苷的苷元(奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素)的HPLC測定方法，應(yīng)用胃腸道組織提取物體外孵育法，測定三者的質(zhì)量濃度，研究兩色金雞菊中3種黃酮苷在腸道是否發(fā)生水解代謝及代謝程度。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1260型液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Centrifuge 5415 R型低溫離心機(德國Eppendorf公司)；IKAT10 basic型電動組織勻漿機(德國IKA公司)；AL104-S電子分析天平，320 pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；GBL-88B渦旋震蕩儀(?？谄淞重悹杻x器制造有限公司)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

圖1黃酮苷及其苷元的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.馬里苷(CCT-1);2.奧卡寧；3.異馬里苷(CCT-2)；4.異奧卡寧；5.花旗松素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CCT-3)；6.花旗松素。

Fig.1 The chemical structures of flavonoid glycosides and their aglycones

1.marein (CCT-1)；2.okanin；3.flavanomarein (CCT-2)；4.isookanin；5.taxifolin-7-O-β-D-glucopyranoside (CCT-3)；6.taxifolin.

1.2試藥 CCT-1、CCT-2、CCT-3、奧卡寧和異奧卡寧(均為實驗室自制，經(jīng)UV法、1H-NMR法、13C-NMR法和 Q-TOF法結(jié)構(gòu)鑒定，并應(yīng)用HPLC法測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98.5%)；花旗松素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，HPLC級，南京蘇郎生物科技有限公司)；甲醇為色譜純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙腈為色譜純(美國天地有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.13種黃酮苷元的對照品溶液和質(zhì)控溶液 精密稱取奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素適量，用DMSO溶解，分別配制成質(zhì)量濃度均為30.0 mg·mL-1的儲備液；精密移取適量儲備液混合，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇逐步稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0.15，0.3，0.6，2.4，9.6和19.2 g·mL-1的對照品溶液；同法制得質(zhì)量濃度分別為0.15，0.3，9.6和15.0 g·mL-1的質(zhì)控溶液。

2.2色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；以1 mL·L-1甲酸(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(0～2.5 min，10%B～16.5%B；2.5～5.0 min，16.5%B～34%B；5.0～5.1 min，34%B～50%B；5.1～7.0 min，50%B～50%B；7.0～7.1 min，50%B～16%B；7.1～10 min，16%B～16%B)；柱溫：30 ℃；檢測波長:380 nm(CCT-1，奧卡寧)、284 nm(CCT-2，異奧卡寧；CCT-3，花旗松素)；流速:1.0 mL·min-1；進樣體積：5 μL；分析時間：10 min。

2.3大鼠胃腸道組織提取物的制備 大鼠斷頭處死，迅速取出胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸和盲腸，用生理鹽水沖洗，加磷酸鹽緩沖溶液 (10 mmol·L-1,pH值為7.0)，制備勻漿，勻漿液離心，上清液即為組織提取物，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度[19]。

2.4黃酮苷在組織提取物中的孵育 取適量組織提取物與磷酸鹽緩沖溶液，混勻，加黃酮苷溶液適量，反應(yīng)終體系為100 μL(甲醇含量不得超過1%)，于37 ℃孵育。加乙腈200 μL，渦旋，離心，取上清液100 μL，進樣，用于HPLC分析。

2.5CCT-1、CCT-2和CCT-3去糖基代謝率的計算 以胃腸道組織提取物孵育液中測得的黃酮苷元質(zhì)量濃度換算發(fā)生去糖基代謝的黃酮苷質(zhì)量濃度，求得黃酮苷去糖基代謝率(%)=Ci/C0×100%，Ci為發(fā)生去糖基代謝的黃酮苷質(zhì)量濃度，C0為反應(yīng)體系中加入的黃酮苷初質(zhì)量濃度。

2.6HPLC方法學(xué)考察

2.6.1奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在孵育體系中的選擇性 見圖2。由圖2可知，在本色譜條件下，在380 nm波長處檢測奧卡寧，在284 nm波長處檢測異奧卡寧和花旗松素，三者峰形良好，孵育體系中相關(guān)物質(zhì)不干擾三者測定，奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素的出峰時間依次為7.1，6.3和6.5 min。

2.6.2奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在組織提取液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系 按照2.1和2.4項下方法進行操作，取上清液進行HPLC分析，各質(zhì)量濃度進行3樣本分析，記錄色譜圖。以分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、分析物的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進行回歸運算，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素均在0.15～19.2 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好(r≥0.999)。

2.6.3奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在組織提取液中的回收率 按照2.1項下方法配制奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素的質(zhì)控溶液，按照2.4項下方法處理樣品溶液，取上清液進行HPLC分析，各質(zhì)量濃度進行5次樣本分析，記錄色譜圖中奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素的峰面積Ai，另取以初始流動相直接配制相同理論質(zhì)量濃度的奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素溶液，同法進樣，記錄峰面積A0，絕對回收率=Ai/A0×100%。結(jié)果表明，奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在組織提取液中的絕對回收率在85.1%～100.7%之間。

圖2組織提取液中奧卡寧、異奧卡寧、花旗松素的HPLC圖

A.空白樣品；B.對照樣品；C.被測樣品；1. 奧卡寧; 2.異奧卡寧; 3.花旗松素。

Fig.2 HPLC chromatograms of okanin，isookanin，taxifolin in cell free fractions

A.blank; B.control samples; C.measured samples；1.okanin; 2.isookanin; 3.taxifolin.

2.6.4奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在組織提取液中的精密度 按照2.6.3項下方法操作，各質(zhì)量濃度進行5次樣本分析。將奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，日內(nèi)精密度(RSD)在1.4%～12.8%之間，日間精密度(RSD)在1.8%～14.7%之間，表明該方法精密度符合要求。

2.7孵育體系中底物質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量濃度及孵育時間的選擇 見圖3。由圖3A可知，質(zhì)量濃度為4.5～144.0 μg·mL-1CCT-1、CCT-2、CCT-3與蛋白質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL-1的組織提取物孵育30 min，產(chǎn)生的奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素隨底物質(zhì)量濃度的增加而增加。因此，本實驗選擇底物質(zhì)量濃度為36.0 μg·mL-1。由圖3 B可知，酶蛋白質(zhì)量濃度在0.75～1.5 mg·mL-1范圍內(nèi)與CCT-1、CCT-2和CCT-3孵育30 min，產(chǎn)生的奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素質(zhì)量濃度呈線性上升趨勢，因此，選擇酶質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL-1。由圖3C可知，酶蛋白溶液與CCT-1、CCT-2和CCT-3孵育20～45 min，產(chǎn)生的奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素呈線性增加，因此確定孵育時間為45 min。

2.8大鼠胃腸道不同部位對黃酮苷水解代謝的影響 在2.7項下優(yōu)化的孵育條件下，考察黃酮苷在大鼠胃腸道不同部位提取物中的水解代謝率。結(jié)果見圖4。CCT-1、CCT-2和CCT-3在大鼠小腸提取物中均能發(fā)生水解代謝，生成相應(yīng)的苷元奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素，但在胃、結(jié)腸和盲腸中不能發(fā)生水解代謝。CCT-1、CCT-2和CCT-3在空腸和回腸中的去糖基代謝率高于十二指腸中的代謝率，分別為61.8%～64.8%，29.7%～35.3%和13.7%～20.5%。

圖3孵育體系中底物質(zhì)量濃度(A)、酶質(zhì)量濃度(B)及孵育時間(C)對黃酮苷水解代謝的影響(n=3)

Fig.3 Effect of substrate concentration (A)，protein concentration (B) and incubated time (C) on the hydrolyzed metabolism of flavone glycosides in incubation system (n=3)

圖4CCT-1、CCT-2和CCT-3在大鼠胃腸道組織提取物中的代謝率(n=6)

Fig.4 Hydrolyzation ratio of CCT-1，CCT-2 and CCT-3 in cell-free extract from rat gastrointestinal tract (GIT)(n=6)

3 討論

文獻報道，黃酮苷元母核類型、糖類型、糖與苷元連接的位置與數(shù)量等均可影響黃酮苷去糖基代謝的程度[14]。CCT-1、CCT-2和CCT-3基本母核分別屬于查爾酮類(CCT-1)、二氫異黃酮類(CCT-2)和黃酮醇類(CCT-3)。由去糖基代謝實驗結(jié)果可知，3個黃酮苷在胃腸道中的去糖基代謝程度有很大差異，在大鼠組織提取物中，去糖基代謝程度由高到低依次為CCT-1>CCT-2>CCT-3，這可能是由腸道酶對3種黃酮苷的去糖基代謝具有底物選擇性所致。有研究報道，落新婦苷(花旗松素-3-O-鼠李糖苷)口服給藥后，血漿中并未檢測到其苷元花旗松素[20]，而本文證實CCT-3(花旗松素-7-O-葡萄糖苷)能在胃腸道發(fā)生去糖基代謝，異槲皮苷(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)能在胃腸道去糖基代謝生成異槲皮素而吸收，而金絲桃苷(槲皮素-3-O-半乳糖苷)卻以糖苷的形式吸收入血[15]，這些都驗證了去糖基代謝酶的底物選擇性。本研究體外孵育實驗表明，兩色金雞菊中CCT-1、CCT-2和CCT-3均可被胃腸道黏膜水解酶代謝為相應(yīng)苷元，CCT-1的去糖基代謝程度最大，最弱的是CCT-3，提示兩色金雞菊進入體內(nèi)后，其苷和水解代謝生成的苷元均有可能為有效成分之一，該結(jié)果為兩色金雞菊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供理論依據(jù)。