師志強，張雪梅，薛志遠，陳 宇，楊亞飛，封士蘭*，趙良功

(1.蘭州大學藥學院，蘭州 730000；2.昆明學院醫(yī)學院，昆明 650214；3.蘭州大學第二醫(yī)院，蘭州 730000)

植物多糖具有廣泛的生物活性，受到研究學者的高度關(guān)注[1-3]。由于多糖結(jié)構(gòu)中缺少發(fā)光基團，難以直接檢測?，F(xiàn)多采用熒光物質(zhì)對多糖進行標記，進而開展多糖的分子作用機制和代謝動力學研究[4]。FITC具有量子產(chǎn)率高、壽命長、光穩(wěn)定性好和溫度系數(shù)低等優(yōu)點，是目前應用最廣泛的熒光素之一[5]。目前已實現(xiàn)對麥冬多糖、樹舌多糖、枸杞多糖、小刺猴頭菌多糖和紅毛五加多糖等的FITC標記[4，6-9]。

紅芪多糖(Hedysarumpolybotys saccharide，HPS)具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力、抗骨質(zhì)疏松和抗肝纖維化等生物活性[10-14]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPS-3由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成[15]。本文利用紅芪多糖具有還原性末端的特點，通過半縮醛基的還原胺化反應引入仲氨基，進而與FITC發(fā)生親核反應，實現(xiàn)多糖的熒光標記。并對HPS-3-FITC在小鼠體內(nèi)的組織分布進行研究，為其代謝組學和藥效作用機制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1儀器 FA2014型電子分析天平(上海市安亭電子儀器廠)；紫外可見分光光度計(美國Perkin Elmer公司)；RF-5301pc型熒光分光光度計(日本島津公司)；CR22G Ⅱ型離心機(日本日立公司)；冷凍干燥器(美國labconco公司)；N1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)；T10 basic ULTRA-TURRAX型分散機(德國IKA公司)。

1.2材料 紅芪多糖3由本課題組自制[15]；異硫氰酸熒光素、氰基硼氫化鈉和4-羥基苯乙胺(Tyr)均購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、苯酚和硫酸等試劑均為市售分析純。

1.3動物 昆明種小鼠90只，雄性，體質(zhì)量20±2 g，由蘭州大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(甘)2015-0012)。

2 方法

2.1HPS-3的熒光標記 取400 mg HPS-3溶于15 mL 0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(PBS)中(pH值為8.0)，依次加入400 mg Tyr和150 mg 氰基硼氫化鈉，于37 ℃水浴反應96 h，間或振蕩。反應完畢，離心，取上清液，過Sephadex G-100 柱，蒸餾水洗脫，收集洗脫液，苯酚-硫酸法測定各管糖含量及280 nm處的吸光度值，繪制HPS-3-Tyr的洗脫曲線，按照洗脫曲線收集洗脫液，冷凍干燥，得HPS-3-Tyr。

將HPS-3-Tyr溶于蒸餾水，用0.5 mol·L-1的Na2CO3調(diào)節(jié)pH值至8.5，加50 mg FITC，室溫下避光反應過夜，向反應物中加入4倍量無水乙醇，有黃綠色沉淀析出，離心，棄上清液，沉淀加水復溶，乙醇再次沉淀，反復3次，條件同上。用水溶解沉淀，溶液上Sephadex G-100柱純化，蒸餾水洗脫，測定各管糖含量和熒光吸收值(λex=492 nm，λem=518 nm)，收集相應洗脫液，冷凍干燥，得HPS-3-FITC，避光保存[16]。

2.2UV-Vis光譜和熒光分光光譜掃描分析 取HPS-3、HPS-3-Tyr和HPS-3-FITC適量，分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的溶液，在200～800 nm范圍內(nèi)進行紫外可見光譜掃描。在激發(fā)波長400～550 nm和發(fā)射波長 450～600 nm 范圍內(nèi)進行熒光光譜掃描。

2.3熒光取代度測定 精密移取質(zhì)量濃度為0.122 8 μg·mL-1的FITC溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL，分別加入7支錫箔紙包裹的刻度試管，加入PBS緩沖液定容至10.0 mL。以PBS緩沖液為空白對照，依次測定各管的熒光強度。以FITC的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、熒光強度為縱坐標(y)，繪制標準曲線，并計算回歸方程。將HPS-3-FITC配制成質(zhì)量濃度為0.359 2 μg·mL-1的PBS緩沖液，測定其熒光強度，代入回歸方程，計算HPS-3-FITC的熒光取代度。

2.4小鼠各組織中HPS-3-FITC和FITC定量分析方法的建立 以心臟中HPS-3-FITC的定量分析方法建立為例。

2.4.1對照品溶液的制備 精確稱取HPS-3-FITC樣品適量，配制成質(zhì)量濃度為0.576 8 mg·mL-1的對照品溶液。取小鼠空白組心臟勻漿液200 mL，加入適量上述制備的的對照品溶液，分別制備高(28.84 μg·mL-1)、中(2.884 μg·mL-1)和低(0.360 μg·mL-1)3個質(zhì)量濃度的組織樣品，作為質(zhì)控樣品。

2.4.2標準工作曲線的繪制 精密移取小鼠空白組心臟勻漿液200 μL,加入2.4.1項下制備的對照品溶液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.360，0.721，1.442，2.884，5.768，14.42和28.84 μg·mL-1的系列溶液，加PBS緩沖液補足至2.5 mL，測定熒光強度，同時以PBS緩沖液替代HPS-3-FITC對照品溶液作為空白對照。以組織勻漿液中待測樣品HPS-3-FITC的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，測定的熒光強度扣除空白組織勻漿液的熒光強度為縱坐標(y)，繪制標準曲線，并計算回歸方程[17]。

2.4.3方法回收率與精密度 取2.4.1項下制備的高、中和低3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，測定熒光強度，代入標準曲線求得實測質(zhì)量濃度，計算方法回收率。1 d內(nèi)連續(xù)測定，得到日內(nèi)差；連續(xù)3 d進行測定，得到日間差。

2.4.4方法穩(wěn)定性 取2.4.1項下制備的高、中和低3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，在室溫下放置24 h后，測定熒光強度，代入標準曲線分別求得樣品的質(zhì)量濃度，計算RSD值。

2.5生物樣品采集及處理 取90只昆明小鼠，隨機分成15組，每組6只，其中7組尾靜脈注射160 mg·kg-1HPS-3-FITC，7組尾靜脈注射2.74 mg·kg-1FITC，剩余1組尾靜脈注射生理鹽水作為空白組，給藥后0.25，0.5，1，2，4，8和24 h摘眼球采血后處死，立即解剖，采集心、肝、脾、肺、腎、胃、腸和腦，用PBS緩沖液洗凈，濾紙吸干，精密稱定質(zhì)量，加入9倍體積的PBS緩沖液，制備組織勻漿液。取組織勻漿液200 μL，加入PBS緩沖液補足2.5 mL，混勻，使用熒光分光光度計在λex=492 nm，λem=518 nm條件下測定熒光強度。

3 結(jié)果與討論

3.1HPS-3-FITC的合成 多糖胺化還原后產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-100 柱的洗脫曲線見圖1A。多糖峰與Tyr第一吸收峰重合，紫外可見掃描光譜顯示：HPS-3-Tyr在280 nm附近有1個明顯的吸收峰，說明多糖與酪胺成功結(jié)合，見圖2。

HPS-3-Tyr經(jīng)FITC親核加成后洗脫曲線見圖1B。多糖峰與FITC熒光吸收峰重合，在圖2中HPS-3-FITC在490 nm附近有1個明顯吸收峰，表明FITC已被偶聯(lián)到HPS-3-Tyr上。

3.2熒光分光光譜分析 HPS-3-FITC凍干后為橙黃色粉末，其水溶液呈黃綠色。經(jīng)過熒光分光光譜掃描發(fā)現(xiàn)，未標記的HPS-3沒有激發(fā)波長λex和發(fā)射波長λem；FITC：激發(fā)波長λex=493 nm，發(fā)射波長λem=521 nm；HPS-3-FITC：激發(fā)波長λex=492 nm，發(fā)射波長λem=518 nm?？芍狥ITC結(jié)合多糖后激發(fā)波長和發(fā)射波長未見明顯變化。

圖1HPS-3-Tyr和HPS-3-FITC的洗脫曲線

A.HPS-3-Tyr；B.HPS-3-FITC。

Fig.1 Elution curve of HPS-3-Tyr and HPS-3-FITC

A.HPS-3-Tyr；B.HPS-3-FITC.

圖2HPS-3，HPS-3-Tyr和HPS-3-FITC紫外可見掃描圖譜

Fig.2 UV-Vis spectra of HPS-3,HPS-3-Tyr and HPS-3-FITC

3.3熒光取代度 FITC的標準曲線回歸方程為：y=20.648x+38.168(2.456～17.92×10-3) μg·mL-1，r=0.999 2)，經(jīng)檢測HPS-3-FITC的熒光強度為164.826，計算HPS-3-FITC的熒光取代度為1.71%。

3.4各組織中HPS-3-FITC定量分析方法研究結(jié)果

3.4.1線性關(guān)系 以組織勻漿液中待測樣品HPS-3-FITC的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、測定的熒光強度扣除空白組織勻漿液的熒光強度為縱坐標(y)，繪制標準曲線，各組織的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1，均滿足生物樣品測定要求。

3.4.2回收率與精密度 各樣品的回收率與精密度結(jié)果見表2。均滿足生物樣品的測定要求。

3.4.3方法穩(wěn)定性 各樣品在室溫下放置24 h后，HPS-3-FITC的含量均大于加入量的88%，RSD值均小于10%；滿足生物樣品的測定要求。

表1HPS-3-FITC在血漿及各組織的線性回歸方程

Tab.1 Equations of linear regression of HPS-3-FITC in plasma and tissues

樣品標準曲線線性范圍/μg·mL-1r心y=6.090 5x-1.296 10.360～28.840.998 6 肝y=4.068 4x+1.087 40.360～57.680.999 7脾y=5.890 9x-0.289 10.360～28.840.999 8 肺y=5.971 9x-1.375 30.360～115.360.999 8 腎y=8.225 8x-1.292 30.360～86.520.999 5 胃y=5.136 8x-0.149 60.360～28.840.999 6 腸y=6.573 4x-1.704 70.360～28.840.999 2 腦y=10.637x+0.732 90.360～28.840.999 5

3.5各組織中FITC定量分析方法研究結(jié)果 參照2.4項下方法，F(xiàn)ITC在各樣品中的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99；各樣品的高、中和低質(zhì)量濃度的回收率為89.29%～103.18%，RSD值均小于13.1%，各樣品的高、中和低質(zhì)量濃度的日內(nèi)和日間精密度RSD值均小于11.2%。各樣品高、中和低3個質(zhì)量濃度的穩(wěn)定性良好，RSD值均小于12.7%，均滿足生物樣品的測定要求。

3.6組織分布及靶向性研究 尾靜脈注射給藥后，采集的組織樣品按照2.5項下方法測定藥物質(zhì)量濃度。根據(jù)各樣品中的藥物質(zhì)量濃度繪制藥物質(zhì)量濃度-時間曲線，采用梯形法計算各組織中藥物的AUC值，并以各組織的AUC總和為參比，計算各組織的Te(靶向效率)，Te=AUC÷∑AUC×100%，結(jié)果見表3。通過比較各組織的Te值，可發(fā)現(xiàn)各組織對HPS-3-FITC和FITC靶向效率不完全一致，HPS-3-FITC主要集中在腎、肝和肺3個組織，三者的Te值之和為87.73%，F(xiàn)ITC主要集中在肝和腎組織，二者的Te值之和為97.28%。兩者的臟器分布情況不一致，間接說明了HPS-3-FITC給藥后各組織中的熒光響應來源于標記后的多糖。

表2HPS-3-FITC的方法回收率與精密度

樣品加入量/μg·mL-1測得量/μg·mL-1平均回收率/%RSD/%RSD/%日內(nèi)差日間差心0.3600.374±0.032103.673.115.225.532.8842.844±0.04398.624.417.336.1128.84027.376±0.03494.933.533.502.81肝0.3600.340±0.03994.354.118.327.772.8842.923±0.057101.355.635.664.4857.68053.705±0.00893.110.842.073.34脾0.3600.342±0.06494.896.749.008.842.8842.705±0.02493.792.541.624.0428.84027.914±0.04796.794.891.255.35肺0.3600.360±0.03899.903.822.854.235.7685.522±0.05595.735.723.816.36115.360110.026±0.04495.384.611.544.78腎0.3600.353±0.07898.037.925.303.485.7685.339±0.02792.572.913.944.3786.52083.175±0.01396.131.365.144.10胃0.3600.366±0.085101.428.418.898.902.8842.873±0.05099.615.024.865.5928.84027.738±0.01196.181.123.183.92腸0.3600.347±0.02596.162.569.096.262.8842.798±0.06097.016.145.174.9728.84029.289±0.044101.554.343.854.69腦0.3600.322±0.05889.306.497.467.732.8842.835±0.02798.292.711.873.5328.84026.267±0.01791.081.871.782.54

表3HPS-3-FITC和FITC在血漿和各組織中的藥動學參數(shù)

Tab.3 Pharmacokinetic parameters of HPS-3-FITC and FITC in plasma and tissues (n=6)

4 結(jié)論

本研究通過胺化還原的方法，在HPS-3的還原性末端的半縮醛基引入酪胺生成HPS-3-Tyr，再通過與FITC發(fā)生親核反應生成HPS-3-FITC，從而實現(xiàn)對HPS-3多糖的熒光標記。產(chǎn)物經(jīng)紫外可見掃描光譜和熒光光譜分析，證實標記成功，其熒光取代度為1.71%。

使用熒光分光光度法建立了小鼠組織中HPS-3-FITC和FITC的定量分析方法，該方法簡單快速，其線性、穩(wěn)定性、回收率和精密度均符合生物樣品的測定要求，避免了液相色譜法測定時復雜的樣品前處理過程。根據(jù)HPS-3-FITC給藥后各組織的AUC值，組織中含藥量分布順序從高到低依次為腎、肝、肺、心、脾、腸、胃、腦，其中絕大多數(shù)聚集在腎、肝和肺。腎臟分布最多，說明腎臟對HPS-3有很強的攝取能力，祁雪艷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖有抗糖尿病腎病的作用，推測紅芪多糖可能直接作用于腎臟而發(fā)揮藥效，且藥物主要通過腎臟排出；肝臟分布其次，說明肝臟對HPS-3有較強的攝取能力，藥物主要通過肝臟代謝。前期的藥效學實驗研究結(jié)果表明，紅芪多糖具有良好的抗肝損傷作用[19]。推測紅芪多糖直接作用于肝臟靶器官而發(fā)揮藥效；肺部也有較大吸收可能是肺部存在大量的血管，靜脈注射后，大量藥物進入肺部，提示HPS-3可用于治療某些肺部疾病，與李菲等[20]研究結(jié)果一致。

實驗結(jié)果表明，F(xiàn)ITC對紅芪多糖HPS-3進行熒光標記是成功的，建立的體內(nèi)組織中定量分析方法和組織分布實驗為進一步研究紅芪多糖的藥效作用機制和相關(guān)代謝組學奠定了基礎(chǔ)。