陳文良，肖蘭華，朱 偉，覃 軍

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006)

天雄為毛茛科植物卡氏烏頭(AconitumcarmichaeliDebx.)的側(cè)根，炮天雄為天雄經(jīng)高溫炮制的加工品，為附子飲片商品規(guī)格之一[1-2]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載炮天雄的功效主要有溫陽(yáng)、止痛和祛風(fēng)?，F(xiàn)代研究表明，炮天雄補(bǔ)陽(yáng)補(bǔ)虛的功效比附子強(qiáng)，且毒性大大降低。炮天雄高效低毒的特性使其在嶺南、港澳、東南亞地區(qū)被廣泛作為食療藥材和保健品使用，主治元陽(yáng)素虛和腎虧陽(yáng)虛證[3-5]。目前，對(duì)炮天雄化學(xué)成分的研究主要是生物堿，對(duì)其他成分的研究未見(jiàn)。多糖作為炮天雄主要成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力和降血脂作用，在腫瘤、風(fēng)濕性免疫疾病和心血管疾病治療等方面有很好的應(yīng)用前景，具有一定的研究?jī)r(jià)值[6-8]。本文對(duì)炮天雄多糖的提取工藝進(jìn)行研究,將有助于完善炮天雄的基礎(chǔ)理論，同時(shí)對(duì)開(kāi)發(fā)和利用多糖亦有重要意義。本次實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法提取炮天雄中的多糖，單因素實(shí)驗(yàn)研究超聲功率、超聲時(shí)間和液料比3個(gè)因素對(duì)炮天雄多糖得率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化炮天雄多糖的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1儀器 JJ500型電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)；XT-A400型粉碎機(jī)(永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)；HW512型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Spectrumlab 22pc型可見(jiàn)分光光度計(jì)，5804R型高速冷凍離心機(jī)(上海棱光技術(shù)有限公司)。

1.2試藥 炮天雄購(gòu)于廣州市藥材公司中藥飲片廠(批號(hào)YPA5A0001)，經(jīng)鑒定為毛茛科植物烏頭子根的加工品。葡萄糖、濃硫酸和苯酚均為分析純，均購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。

2 方法

2.1供試品溶液的制備 精密稱取炮天雄粉末(過(guò)50目篩)2 g，加入一定液料比的蒸餾水，按照設(shè)定的超聲條件提取，置于80 ℃水浴鍋中放置3 h，冷卻，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清液稀釋到合適程度，作為供試品溶液。

2.2對(duì)照品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葡萄糖對(duì)照品1.0 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，得到質(zhì)量濃度為1 g·L-1的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密吸取上述葡萄糖對(duì)照品溶液0.10，0.20，0.30，0.40和0.60 mL，分別置于10 mL試管中，用水稀釋至1.00 mL，加質(zhì)量濃度為50 g·L-1的苯酚水溶液1 mL，搖勻后立即加濃硫酸5.00 mL。放置冷卻，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量。以吸光度值為縱坐標(biāo)(y)、葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x)，求其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3炮天雄多糖的含量測(cè)定 取2.1項(xiàng)下制備的供試品溶液，加質(zhì)量濃度為50 g·L-1的苯酚水溶液1 mL，搖勻后立即加濃硫酸5.00 mL。放置冷卻，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖得率。

多糖含量=m×D×0.9

多糖得率(%)=(多糖含量/M)×100%

公式中m為標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算的含糖量(mg)；D為稀釋倍數(shù)；0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)換為葡聚糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)；M為炮天雄粉末質(zhì)量(g)。

2.4單因素實(shí)驗(yàn) 選取超聲功率、超聲時(shí)間和液料比3個(gè)因素，分別設(shè)置3個(gè)水平進(jìn)行考察，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)選取各因素最佳水平。

2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以超聲功率、超聲時(shí)間和液料比為自變量，多糖得率為響應(yīng)值指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，并用其進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以確定炮天雄多糖的最佳提取條件，見(jiàn)表1。

表1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

因素水平-101超聲功率/W210240270超聲時(shí)間/min101520液料比15∶120∶125∶1

3 結(jié)果

3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 以吸光度值為縱坐標(biāo)(y)、葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x)，得回歸方程：y=9.435 1x+0.000 7，r=0.999 7，線性范圍為0.01～0.06 mg。

3.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.2.1超聲功率對(duì)多糖得率的影響 在液料比為30∶1、超聲時(shí)間為10 min的條件下，考察不同的超聲功率180，210，240，270和300 W(超聲清洗器的最大功率為300 W，只能設(shè)定百分比)對(duì)提取炮天雄多糖的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)超聲功率小于240 W時(shí)，炮天雄多糖得率隨超聲功率的增大而逐漸增高；當(dāng)超聲功率大于240 W時(shí)，炮天雄多糖得率明顯下降。因此，超聲功率在240 W最合適。

3.2.2超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 在液料比為30∶1、超聲功率為240 W的條件下，考察不同的超聲時(shí)間5，10，15，20和25 min對(duì)提取炮天雄多糖的影響。結(jié)果顯示，超聲時(shí)間小于15 min時(shí)，炮天雄多糖得率與超聲時(shí)間呈正相關(guān)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增高；當(dāng)超聲時(shí)間大于15 min時(shí)，炮天雄多糖得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。因此，超聲時(shí)間控制在15 min最合適。

3.2.3液料比對(duì)多糖得率的影響 在提取時(shí)間為10 min、超聲功率為240 W的條件下，考察不同的液料比10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1對(duì)提取炮天雄多糖的影響。結(jié)果顯示，液料比小于20∶1時(shí)，炮天雄多糖得率明顯增高；當(dāng)液料比大于20∶1時(shí)，炮天雄多糖得率反而降低。綜合考慮后續(xù)濃縮的需要，選取液料比為20∶1最合適。

3.3響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

3.3.1響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，并用其進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Design and results of response surface methodology

實(shí)驗(yàn)號(hào)超聲功率/W超聲時(shí)間/min液料比多糖得率/%1-10141.522-1-1045.3430-1145.62410145.815-10-146.106-11042.38711044.7780-1-144.38901143.431000045.05111-1044.671210-144.771300046.141401-145.051500045.91

表3方差回歸分析結(jié)果

Tab.3 ANOVA analysis of the results

方差來(lái)源平方和自由度均方FPModel23.1192.575.520.037 2A-超聲功率2.7412.745.890.059 6B-超聲時(shí)間2.4012.405.160.072 4C-液料比1.9211.924.130.097 8AB 2.3412.345.030.074 9AC7.9017.9016.980.009 2BC2.0412.044.400.090 1A22.0212.024.350.091 5B21.6611.663.560.117 7C20.6210.621.330.300 2殘值2.3350.47- - 失擬項(xiàng)1.6630.551.680.394 1純誤差0.6620.33- - 總和25.4414-- -

注：P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

由表3可知，響應(yīng)面模型顯著(P=0.037 2，P<0.05)，而失擬項(xiàng)不顯著(P=0.394 1，P>0.05)，說(shuō)明干擾實(shí)驗(yàn)的未知因素很少。r=23.11/25.44=0.908 4，大于0.8，表明該回歸方程的相關(guān)度較好，響應(yīng)面模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合度較好。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)面之間的真實(shí)關(guān)系，可利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。在選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)炮天雄多糖得率的影響依次為：A.超聲功率>B.超聲時(shí)間>C.液料比。

3.3.2各因素的交互作用分析 響應(yīng)面分析3D曲面圖及其對(duì)應(yīng)的等高線圖見(jiàn)圖1至圖3。由圖可知，任意2個(gè)影響因素對(duì)炮天雄多糖得率的交互影響規(guī)律。

由圖1可知，在最佳液料比為20∶1時(shí)，隨著超聲功率的增大和超聲時(shí)間的增長(zhǎng)，炮天雄多糖得率均呈先增高后降低的趨勢(shì)。

圖1超聲功率(A)和超聲時(shí)間(B)對(duì)炮天雄多糖得率的影響

Fig.1 Effects of the ultrasonic-power (A) and ultrasonic-time (B) on extraction yield of polysaccharides from Processed Tianxiong

圖2超聲功率(A)和液料比(C)對(duì)炮天雄多糖得率的影響

Fig.2 Effects of the ultrasonic-power (A) and liquid-solid ratio (C) on extraction yield of polysaccharides from Processed Tianxiong

圖3超聲時(shí)間(B)和液料比(C)對(duì)炮天雄多糖得率的影響

Fig.3 Effects of the ultrasonic-time (B) and liquid-solid ratio (C) on extraction yield of polysaccharides from Processed Tianxiong

由圖2可知，在最佳超聲時(shí)間為15 min時(shí)，隨著超聲功率和液料比的增大，炮天雄多糖得率均呈先增高后降低的趨勢(shì)，且可以看到超聲功率和液料比的交互作用極顯著(P<0.01)。

由圖3可知，在最佳功率為240 W時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和液料比的增大，炮天雄多糖得率均呈先增高后降低的趨勢(shì)。

3.3.3最佳提取條件的確定 根據(jù)Design-Expert 8.0軟件數(shù)據(jù)分析結(jié)果，炮天雄多糖的最佳提取條件為超聲功率269.97 W，超聲時(shí)間13.20 min，液料比25∶1，在此條件下，炮天雄多糖得率為46.14%。考慮到實(shí)驗(yàn)設(shè)備的局限性和實(shí)驗(yàn)操作的方便性，將優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行修正，即得到超聲功率270 W，超聲時(shí)間13 min，液料比25∶1。根據(jù)修正條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到炮天雄多糖的實(shí)際得率為45.91%，與理論值相近，說(shuō)明擬合效果較好。

4 討論

多糖是由醛糖或酮糖通過(guò)苷鍵連接在一起的多聚物，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一[9-10]。響應(yīng)曲面法是以較少實(shí)驗(yàn)次數(shù)和較短時(shí)間對(duì)所選的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究的工藝優(yōu)化策略，集統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)建模和計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體。與正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化法相比，響應(yīng)曲面法不僅能獲得最佳的工藝參數(shù)，更能全面考察各因素之間的相互影響[11-14]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助熱水浸提法提取炮天雄多糖，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，在選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)炮天雄多糖得率的影響依次為：超聲功率>超聲時(shí)間>液料比，得出其最佳提取條件為：超聲功率240 W，超聲時(shí)間15 min，液料比20∶1。用響應(yīng)面分析法進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化并修正的結(jié)果為：超聲功率270 W，超聲時(shí)間13 min，液料比25∶1，炮天雄多糖的理論得率為46.14%，實(shí)際得率為45.91%，此回歸模型預(yù)測(cè)各因素與得率間的關(guān)系比較可靠，響應(yīng)面法優(yōu)化炮天雄多糖超聲提取的工藝可行。

炮天雄為附子飲片的一種規(guī)格，但因炮天雄選材和炮制工藝的不同，導(dǎo)致炮天雄的功效和性質(zhì)與附子不同，炮天雄選的是附子個(gè)大質(zhì)量較好的，所含有效成分較高，炮制時(shí)不用切片，減少有效成分的流失，因此炮天雄補(bǔ)陽(yáng)補(bǔ)虛的功效比附子強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，炮天雄單酯型生物堿含量較高，毒性成分雙酯型生物堿含量偏低，說(shuō)明炮天雄有高效低毒的特性，用于臨床更為安全可靠[15-19]。但目前，在大陸對(duì)炮天雄的使用較少，對(duì)炮天雄成分的研究很多都是處于空白階段，沒(méi)有建立完善的活性成分系統(tǒng)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文所建立的炮天雄多糖提取工藝對(duì)其質(zhì)量研究與推廣使用很有意義。