楊 健,郭書臺,竇建衛(wèi)
(1.西安市中醫(yī)醫(yī)院,西安 710003;2.西安綠葉藥物研究有限公司,西安 710054;3.西安交通大學藥學院,西安 710061)
白花蛇舌草為茜草科植物HedyotisdiffusaWilld.的干燥全草,收載于廣西中藥志[1]和江蘇省中藥材標準(1989年版)[2],具有清熱解毒、利濕消癰的作用,臨床主要用于腸癰、疔癤腫毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、濕熱黃疸和小便不利等[1];現代藥理研究表明,本品有抗菌、增強免疫[3-4]、抗衰老和抗腫瘤[5-7]作用。白花蛇舌草主要產于福建、廣東、香港、廣西、海南、安徽和云南等地。白花蛇舌草中含三十一烷、豆甾醇、烏索酸、土當歸酸[8-9]、β-谷甾醇、胡蘿卜苷、熊果酸、2-羥基-3-甲基-1-甲氧基蒽醌、2-羥基-7-甲基-3-甲氧基蒽醌、E-6-O-對甲氧基肉桂?;u屎藤苷甲酯、E-6-O-香豆?;u屎藤苷甲酯[10]、香豆酸、對香豆酸甲酯、2-醛基-5-羥甲基呋喃、槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、胡蘿卜苷[11]、車葉草苷、去乙酰車葉草苷、京尼平苷、10-去氫京尼平苷、交讓木苷、diffusoside A、diffusoside B、松柏苷、雞屎藤次苷甲酯、乙酰雞屎藤次苷甲酯、去乙酰車葉草酸苷甲酯、羥異梔子苷、水晶蘭苷甲酯、galioside 10-acetate、地芰普內酯[12]、雞屎藤次苷甲酯、10-去氫京尼平苷和2-羥基-3-甲基蒽醌等成分[13],此外還含有少量揮發(fā)性成分[14]。
中藥指紋圖譜是一種綜合、可量化的鑒定手段,它是建立在中藥化學成分系統(tǒng)研究的基礎上,主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性,整體性和模糊性為其顯著特點[15-18]。由于白花蛇舌草成分較為復雜,很難將其中的單一成分或某一類成分作為測定指標來進行質量控制,因此考慮將指紋圖譜納入到藥材的質量控制體系中,以便考察藥材和制劑的相關性。本實驗用福建產的白花蛇舌草藥材作為原料基源,采用HPLC法對不同時間采收的藥材進行了指紋圖譜研究,建立了藥材的指紋圖譜控制方法。
1.1儀器 高效液相色譜儀,DIONEX P680 HPLC Pump,UVD170U檢測器,DIONEX Chromeleon 6.80色譜工作站(美國Dionex公司);色譜柱(Phenomenex C18,150 mm×4.6 mm,5 μm),廣州菲羅門科學儀器有限公司;BS110S型分析天平,德國賽多利斯公司;AU250D型0.01 mg分析天平,日本島津儀器有限公司;TDA-8002型恒溫水浴鍋,北京化玻聯醫(yī)療器械有限公司。
1.2試藥 槲皮素對照品(批號10081-200907),熊果酸(批號110742-201202),供含量測定用,由中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈為色譜純,Merck公司生產;水為超純水;其余試劑均為分析純。
福建省為白花蛇舌草的主產地之一,本實驗所用藥材均為福建福清地區(qū)不同采收期的藥材樣品,見表1。
表110批白花蛇舌草藥材來源
Tab.1 The sources of 10 batches ofHedyotisdiffusaWilld.
樣品編號產地批號采收時間1福建201407012014年7月2福建201408022014年8月3福建201409012014年9月4福建201507032015年7月5福建201508012015年8月6福建201509012015年9月7福建201509022015年9月8福建201607012016年7月9福建201608012016年8月10福建201608022016年8月
2.1色譜條件 通過預實驗研究,以C18柱作為分離色譜柱,流速為1.0 mL·min-1,分別在波長203,254,270和360 nm處檢測,梯度洗脫程序見表2。
表2梯度洗脫程序
Tab.2 The gradient elution programs
時間/minA,乙腈/%B,2 mL·L-1磷酸水溶液/%05955892402278603565755545806040856040
結果表明,在梯度洗脫的情況下,以乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液為流動相對樣品中各成分的分離效果較好,在203 nm波長處,檢出的峰更多,且有多個峰的響應值較高,具有明顯的特征性,故檢測波長確定為203 nm。
2.2供試品溶液的制備 取藥材,粉碎,過60目篩,取粉末2 g,置于具塞燒瓶中,加體積分數為70%的乙醇20 mL,超聲提取30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇溶解,移至25 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。
2.3分析時間 在2.1項色譜條件下進樣,考察2 h,結果表明,在85 min內,樣品中所有峰均可完全被洗脫,故分析時間確定為85 min。
2.4參照峰的選擇 根據文獻報道,白花蛇舌草藥材中含有槲皮素、熊果酸、豆甾醇和β-谷甾醇-D-葡萄糖苷等,還含有環(huán)烯醚萜苷類成分和車葉草苷等化學成分[8-14]。選用槲皮素作為對照品進行實驗,結果槲皮素色譜峰很低,說明其在藥材中的含量較少;又考察了熊果酸,結果在本色譜條件下均為較小的色譜峰,有些批次甚至沒有檢出,因此無法采用。經綜合考察對比,供試品色譜圖中峰面積最大的色譜峰與其他色譜峰能分離完全,沒有干擾,經多次實驗判斷比較穩(wěn)定,且在藥材、中間體及成品中均能穩(wěn)定存在,因此將其作為參照峰,計算各項指標。
2.5指紋圖譜及其技術參數 取上述各批白花蛇舌草藥材樣品,按照2.2項下方法制備供試品溶液,在2.1項色譜條件下分別吸取10 μL進樣測定,HPLC圖見圖1。對各批白花蛇舌草藥材供試品指紋圖譜進行分析,見圖2,確定其共有峰作為藥材的特征指紋色譜峰。
圖1白花蛇舌草藥材HPLC圖
Fig.1 Typical HPLC chromatogram ofHedyotisdiffusaWilld.
結果顯示,10批白花蛇舌草藥材指紋圖譜均分離出20多個色譜峰,將其結果導入計算機,比較并采用中藥指紋圖譜相似度軟件計算,從中選定了16個共有峰作為藥材指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰,共有峰占總峰面積的90%以上,見圖3和表3。
以7號共有峰作為參照峰,計算相對保留時間、峰面積比值、平均相對保留時間和平均峰面積比值,結果見表4。計算公式如下:
相對保留時間(tr)=色譜峰保留時間÷參照峰的保留時間
峰面積比值(Ax/As)=色譜峰峰面積(Ax)÷參照峰的峰面積(As)
圖2白花蛇舌草不同批次藥材HPLC圖譜比較
Fig.2 HPLC chromatograms,comparison of theHedyotisdiffusaWilld. samples
圖3白花蛇舌草藥材指紋圖譜
1~16.特征指紋峰。
Fig.3 Fingerprints ofHedyotisdiffusaWilld.
1-16.characteristic fingerprint peak.
白花蛇舌草藥材指紋圖譜共有特征峰其主要參數如下。
相對保留時間(共有峰號):0.213±0.002⑴,0.390±0.002⑵,0.410±0.003⑶,0.640±0.002⑷,0.651±0.002⑸,0.720±0.002⑹,0.737±0.002⑺,0.877±0.005⑻,0.893±0.001⑼,0.928±0.005⑽,0.935±0.001⑾,1(S)⑿,1.035±0.008⒀,1.055±0.001⒁,1.089±0.001⒂,1.117±0.001⒃。
峰面積比值(共有峰號):0.033±0.008 ⑴,0.101±0.025⑵,0.034±0.003⑶,0.027±0.004⑷,0.290±0.026⑸,0.105±0.009⑹,0.078±0.006⑺,0.196±0.044⑻,0.050±0.026⑼,0.115±0.014⑽,0.111±0.014⑾,1(S)⑿,0.240±0.050⒀,0.310±0.038⒁,0.072±0.111⒂,0.033±0.005⒃。
將10批白花蛇舌草藥材指紋圖譜實驗數據導入中藥指紋圖譜相似度軟件(中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版),經中藥指紋圖譜相似度軟件計算,得出白花蛇舌草藥材指紋圖譜的標準指紋圖譜,各批樣品均與標準指紋圖譜比較,進行相似度計算,結果10批樣品的相似度分別為0.995,0.998,0.996,0.998,0.996,0.989,0.998,0.989,0.996和0.997,相似度均大于0.95。
2.6方法學考察
2.6.1精密度實驗 取同一份供試品溶液,連續(xù)進樣5次,考察指紋圖譜相似度變化情況,結果顯示,相似度分別為0.996,0.990,0.994,0.992和0.991。結果表明,連續(xù)5次進樣相似度無明顯變化,RSD值為0.24%,表明儀器的精密度良好。
2.6.2穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液,分別在0,2,4,8,12和24 h取樣檢測,考察指紋圖譜相似度變化情況,測得相似度結果分別為0.995,0.990,0.992,0.989和0.994。結果表明,在24 h內,樣品在各檢測時間點的相似度無明顯變化,RSD值為0.26%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。
2.6.3重復性實驗 取同一批號藥材(20140802)共5份,按照2.2項下方法制備供試品溶液,在2.1項色譜條件下檢測,考察重復性,結果5份樣品的相似度分別為0.992,0.986,0.997,0.989和0.995。結果顯示,同批藥材的5份樣品制備的供試品溶液進樣后測定的相似度無明顯差異,表明該方法重復性良好。
HPLC法是目前藥品質量控制過程中較常用的方法,該方法簡便快捷、準確度高,在指紋圖譜研究過程中常用[19-21]。
同一產地的白花蛇舌草不同采收期的藥材有一定差異,經10個批次產品的測定結果比較后,從中選定了16個共有峰作為藥材指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰,共有峰占總峰面積的90%以上,不同采收期的藥材與標準指紋圖譜對照,相似度結果均在0.9以上。
所建立的該地區(qū)白花舌蛇草藥材的指紋圖譜具有較高的專屬性,可作為藥材的鑒別方法,以該地產的白花蛇舌草作為藥材基源可確保不同批次的產品質量穩(wěn)定。