涂志剛，崔 婧，嚴(yán)耿杰，駱麗珍，李丹萍，周永燦，邱名毅

( 1.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?571126; 2.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228 )

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)，屬鱸形目、鲹科、鯧鲹亞科、鯧鲹屬，俗稱(chēng)金鯧魚(yú)、黃臘鯧，是一種暖水性中上層魚(yú)類(lèi)，在我國(guó)東海、南海和黃海均有分布[1]，為我國(guó)廣東、廣西、海南以及臺(tái)灣等沿海省市深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種之一[2-5]。據(jù)農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局和全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站統(tǒng)計(jì)，2015年海南省僅深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹產(chǎn)量已達(dá)3.5×104t，占全省海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量的45%。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度提高，卵形鯧鲹養(yǎng)殖受細(xì)菌性病原和寄生蟲(chóng)病原影響越來(lái)越嚴(yán)重，特別是刺激隱核蟲(chóng)(Cryptocaryonirritans)病爆發(fā)后，繼發(fā)細(xì)菌性感染對(duì)卵形鯧鲹深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖造成了巨大損失。據(jù)保守統(tǒng)計(jì)，2016年由于這兩種疾病的影響，全國(guó)網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹經(jīng)濟(jì)損失約達(dá)5億元，已經(jīng)成為除臺(tái)風(fēng)外，制約我國(guó)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素。

近年來(lái)，海南省網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹陸續(xù)出現(xiàn)“爛身病”的疾病。據(jù)調(diào)查，該病在海南省網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病率較高，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，每年5—10月均有記錄。主要癥狀表現(xiàn)為身體、背鰭、吻端或眼部有潰爛，獨(dú)游、活力較差、反應(yīng)遲鈍，體表黏液多，背鰭發(fā)黑；解剖發(fā)現(xiàn)，魚(yú)體腹部常伴有積水，肛門(mén)發(fā)紅、腫脹，肝臟呈灰白。為查明該病發(fā)生的原因，于2016年5月份對(duì)海南臨高后水灣和澄邁橋頭深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)爆發(fā)的卵形鯧鲹“爛身病”進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，在病原菌分離鑒定的基礎(chǔ)上利用藥敏紙片法對(duì)病原菌進(jìn)行藥敏分析，旨在為海南后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)卵形鯧鲹“爛身病”防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)類(lèi)

于2016年5月自海南臨高后水灣和澄邁橋頭深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)采集到具有典型“爛身病”癥狀的瀕死卵形鯧鲹，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行疾病常規(guī)檢查并進(jìn)行細(xì)菌分離(圖1)。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

病原菌株分離于患“爛身病”卵形鯧鲹，經(jīng)鑒定后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

試驗(yàn)用培養(yǎng)基分別為2216E普通海水培養(yǎng)基(pH 7.6～7.8)和硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)基。

1.3 病原菌的分離與半致死密度的測(cè)定

1.3.1 病原菌的分離

無(wú)菌操作從病魚(yú)的病灶體表潰瘍處、肝臟、腎臟等組織進(jìn)行細(xì)菌分離，接種于2216E普通海水培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)菌落形態(tài)選擇優(yōu)勢(shì)菌挑取單菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 健康卵形鯧鲹(左)和患有“爛身病”卵形鯧鲹(右)

1.3.2 人工感染

自患病卵形鯧鲹分離的菌株分別用2216E普通海水培養(yǎng)基30 ℃搖床培養(yǎng)16～18 h，6000 r/min離心5 min，棄上清液，加入無(wú)菌生理鹽水，制成1.47×108cfu/mL的菌懸液，腹腔注射10尾卵形鯧鲹，注射量為0.2 mL/尾，設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。對(duì)照組腹腔注射等量無(wú)菌生理鹽水。置于(30±1) ℃圓形桶中充氣養(yǎng)殖，連續(xù)觀察7 d，記錄各組試驗(yàn)魚(yú)活動(dòng)情況、患病情況及死亡數(shù)，并從具有典型“爛身病”的試驗(yàn)魚(yú)肝臟等組織再次進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.3.3 半致死密度的測(cè)定

用無(wú)菌生理鹽水對(duì)1.47×108cfu/mL的菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?～10-3稀釋度的菌懸液分別腹部注射，對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，置于水族箱中飼養(yǎng)。連續(xù)觀察7 d并記錄這組試驗(yàn)魚(yú)的活動(dòng)情況與死亡數(shù)，用Reed-Muench 法計(jì)算半數(shù)致死密度[6]，將單位質(zhì)量半致死密度低于106cfu/(mL·g)菌株確定為強(qiáng)毒株。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征

將純化的菌株劃線接種于硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落特征。同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色和電鏡負(fù)染，觀察菌體形態(tài)特征，其他各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[7]描述的方法進(jìn)行。

1.5 16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

擴(kuò)增16S rDNA的正向引物為P1：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，反向引物為Pr：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′[8]。在25 μL的PCR反應(yīng)體系中含有10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，Taq E聚合酶0.2 μL，引物P1和引物Pr各1 μL，模板1 μL，無(wú)菌水17.3 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；最后72 ℃溫育10 min，4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

將分離菌株16S rRNA基因序列與自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的其同屬細(xì)菌的16S rRNA基因序列一起，運(yùn)用Mega軟件進(jìn)行序列排比，生成mas格式文件。通過(guò)自舉分析進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉數(shù)據(jù)集為1000次。采用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 分離菌株藥敏特征檢測(cè)

藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片法進(jìn)行。分離菌株接種2216E普通海水液體培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，配制密度為1.47×108cfu/mL的菌懸液，將菌液(0.1 mL/皿)均勻涂布于2216E普通海水固體培養(yǎng)基，按操作要求貼上藥敏紙片，每種紙片共3個(gè)重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，并根據(jù)同一藥敏紙片3個(gè)重復(fù)組的平均值判定該藥物對(duì)菌株的敏感性。

2 結(jié)果和分析

2.1 病原菌分離與人工感染

自患病卵形鯧鲹肝臟中共分離到1株優(yōu)勢(shì)菌株QT520，以1.47×108cfu/mL的菌液腹腔注射感染健康卵形鯧鲹，導(dǎo)致感染魚(yú)100%死亡(表1)。人工感染后，病魚(yú)表現(xiàn)活力差、反應(yīng)遲鈍，體表黏液增多，背鰭發(fā)黑，腹部積水，肛門(mén)紅腫以及肝臟呈灰白等癥狀，后期表現(xiàn)為體表潰爛，與采集到的患有“爛身病”卵形鯧鲹癥狀相似。

采用寇氏法測(cè)定該菌株對(duì)卵形鯧鲹的半致死密度為4.2×106cfu/mL，試驗(yàn)魚(yú)的體質(zhì)量為(17±1) g/尾，折合單位質(zhì)量的半致死密度為2.5×105cfu/(mL·g)。

表1 菌株QT520的人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.2 菌落形態(tài)及生理生化特征

菌株QT520在硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，30 ℃培養(yǎng)24 h，菌落呈黃色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，中央稍隆起；革蘭氏染色陰性，短桿狀，稍彎曲；電鏡負(fù)染顯示極生單鞭毛(圖2)。生理生化檢測(cè)結(jié)果表明，該菌株能在35 ℃生長(zhǎng)，氧化酶和接觸酶均為陽(yáng)性，能利用葡萄糖、檸檬酸鈉，不能利用甘露醇、肌醇、山梨糖及蔗糖；精氨酸雙水解酶呈陰性；硝酸鹽(還原)呈陽(yáng)性(表2)。該菌株與哈維弧菌(Vibrioharveyi)參考菌株ATCC14126相比，除不能利用甘露醇，賴(lài)氨酸脫羧酶以及鳥(niǎo)氨酸脫羧酶以及吲哚試驗(yàn)均為陰性外，其他結(jié)果一致。

圖2 菌株QT520革蘭氏染色(a)及電鏡負(fù)染圖片(b)

鑒定項(xiàng)目菌株QT520哈維弧菌ATCC14126鑒定項(xiàng)目菌株QT520哈維弧菌ATCC141264 ℃生長(zhǎng)--蜜二糖--30 ℃生長(zhǎng)++Kohn明膠++35 ℃生長(zhǎng)++賴(lài)氨酸脫羧酶-+40 ℃生長(zhǎng)--鳥(niǎo)氨酸脫羧酶-+革蘭氏染色--脲素酶--運(yùn)動(dòng)性++色氨酸脫氨酶--培養(yǎng)基生長(zhǎng)顏色黃色黃色葡萄糖++0% NaCl生長(zhǎng)--甘露醇-+3% NaCl生長(zhǎng)++肌醇--6% NaCl生長(zhǎng)++山梨醇--8% NaCl生長(zhǎng)++蔗糖--10% NaCl生長(zhǎng)--硝酸鹽(還原)++氧化酶++吲哚試驗(yàn)-+接觸酶++O/129(10 μg)--發(fā)光--O/129(150 μg)++精氨酸雙水解酶--阿拉伯糖--梓檬酸鈉++

注：+：反應(yīng)陽(yáng)性；-：反應(yīng)陰性.

2.3 16S rRNA系統(tǒng)樹(shù)分析

16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果(圖3)表明，菌株QT520與哈維弧菌聚為一支，表明菌株QT520與哈維弧菌親緣關(guān)系最近。經(jīng)16S rRNA基因序列比對(duì)進(jìn)一步證實(shí)，菌株QT520與哈維弧菌菌株同源性達(dá)到99.9%。因此，綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及測(cè)序結(jié)果，確定菌株QT520為哈維弧菌。

2.4 藥敏特征

哈維弧菌QT520對(duì)18種抗生素的敏感性結(jié)果見(jiàn)表3，該菌株對(duì)多西環(huán)素、利福平、先鋒哌酮、頭孢吡肟、派拉西林、頭孢曲松、頭孢哌酮和慶大霉素均敏感，但對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定和頭孢克肟表現(xiàn)為耐藥。

藥物名稱(chēng)藥量μg/片抑菌圈直徑mm敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)(R,I,S)mm多西環(huán)素3025S≤12,13～15,≥16利福平525S≤16,17～19,≥20先鋒哌酮(舒巴坦)7528S≤15,16～20,≥21頭孢吡肟3024S≤14,15～17,≥18頭孢噻肟3020I≤14,15～22,≥23頭孢氨芐3010R≤14,15～17,≥18哌拉西林19925S≤17,18～20,≥21卡那霉素300R≤13,14～17,≥18鏈霉素106R≤11,12～14,≥15頭孢曲松3030S≤13,15～21,≥22頭孢唑啉3015I≤14,15～17,≥18頭孢拉定3010R≤14,15～17,≥18頭孢克肟510R≤15,16～18,≥19恩諾沙星525S≤16,17～22,≥23新霉素3017I≤16,17～23,≥24頭孢哌酮7525S≤15,16～20,≥21四環(huán)素3013R≤14,15～18,≥19復(fù)方新諾明017I<10,10～19,>19慶大霉素1015S≤12,13～14,≥15

注：R表示耐藥，I表示中介，S表示敏感.

3 討 論

卵形鯧鲹為近年來(lái)海南、廣東和廣西等地深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種，相關(guān)病害研究較少，早期周永燦等[9]對(duì)海南省卵形鯧鲹大面積死亡原因進(jìn)行了調(diào)查，分離到一株嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)；王瑞旋等[10]在陵水調(diào)查分離到了一株卵形鯧鲹致病菌——美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種(Photobacteriumdamselaessp.piscicida)；黃婷等[11]報(bào)道了廣西網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹感染海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)和無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae)的病例。然而隨著深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度不斷加大，養(yǎng)殖的病害也日趨嚴(yán)重，其中由細(xì)菌引起的“爛身病”已成為海南后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖的卵形鯧鲹主要病害類(lèi)型之一。據(jù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，該病的發(fā)病高峰期為每年的3—5月和8—11月，此時(shí)養(yǎng)殖水域平均溫度25～30 ℃，與弧菌爆發(fā)的高峰期吻合[12]。每年進(jìn)入8—11月，養(yǎng)殖卵形鯧鲹的攝食和代謝等活動(dòng)旺盛，會(huì)引起養(yǎng)殖水體中殘餌和糞便增多，加上高密度養(yǎng)殖使網(wǎng)箱內(nèi)外水體交換能力下降，從而有利于病原菌的滋生。對(duì)該季節(jié)后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)弧菌總數(shù)分析表明，養(yǎng)殖網(wǎng)箱內(nèi)弧菌密度達(dá)3.5×103cfu/mL，是網(wǎng)箱外及非養(yǎng)殖的外海對(duì)照區(qū)的50倍和1000倍[12]，這可能為深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹疾病爆發(fā)的主要誘因。

本試驗(yàn)從患有“爛身病”卵形鯧鲹肝臟中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株QT520，經(jīng)回歸感染試驗(yàn)確定其為病原菌。菌株QT520在形態(tài)學(xué)和生理生態(tài)特征方面與哈維弧菌參考菌株最為接近。通過(guò)16S rRNA基因序列比對(duì)進(jìn)一步證實(shí)，菌株QT520與哈維弧菌菌株同源性達(dá)99.9%。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及測(cè)序結(jié)果，確定菌株QT520為哈維弧菌。哈維弧菌QT520對(duì)卵形鯧鲹的單位質(zhì)量半致死密度為2.5×105cfu/(mL·g)，屬于強(qiáng)毒菌株。已有研究表明，哈維弧菌對(duì)石斑魚(yú)(Epinephelus)、高體(Serioladumerili)和大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)均有較強(qiáng)的致病力[13-18]。陳獻(xiàn)稿等[15]分離到的哈維弧菌EcGY020401對(duì)斜帶石斑魚(yú)(E.coioides)的半致死劑量達(dá)2.7×106cfu/g，梅冰等[14]分離到的哈維弧菌HS08001對(duì)斜帶石斑魚(yú)的半致死劑量達(dá)1.05×104cfu/g；徐先棟[19]研究了46株哈維弧菌對(duì)斜帶石斑魚(yú)攻毒的毒性，其中有18株菌株屬于強(qiáng)毒株。

養(yǎng)殖過(guò)程中不合理使用抗生素，如誤用、濫用抗生素均會(huì)提高水體中病原菌的耐藥性。不同時(shí)間、不同養(yǎng)殖場(chǎng)分離到的哈維弧菌對(duì)同一種藥物的敏感性差異較大。已有研究表明，哈維弧菌HS08001菌株僅對(duì)慶大霉素、氯霉素和利福平3種藥物高度敏感，對(duì)鏈霉素、卡那霉素和青霉素等18種抗菌藥物不敏感[14]；哈維弧菌EcGY020401對(duì)利福平、四環(huán)素、喹諾酮類(lèi)及頭孢曲松等抗生素較為敏感[15]。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，哈維弧菌QT520株與HS08001株、EcGY020401株有一定的差異，對(duì)利福平、慶大霉素和多西環(huán)素等9種藥物敏感，對(duì)四環(huán)素、鏈霉素和卡拉霉素等6種藥物具有耐藥性。因此，在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中可以參考使用利福平和慶大霉素等敏感性藥物來(lái)防治該病害。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)自海南省深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患爛身病的卵形鯧鲹中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌株QT520，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及16S rRNA基因序列比對(duì)，將該菌株確定為哈維弧菌。人工感染試驗(yàn)表明，哈維弧菌QT520對(duì)卵形鯧鲹的單位質(zhì)量半致死密度為2.5×105cfu/(mL·g)，屬于強(qiáng)毒株型。藥敏分析結(jié)果顯示，哈維弧菌QT520對(duì)利福平、慶大霉素和多西環(huán)素等9種藥物敏感，而對(duì)四環(huán)素、鏈霉素和卡那霉素等6種藥物耐藥。