姚艷玲，袁春營，崔青曼，呂 軍

( 1.松遼水環(huán)境科學(xué)研究所，吉林 長春 130021； 2.天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457 )

近年來，隨著凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，水環(huán)境惡化和種質(zhì)退化導(dǎo)致病害頻發(fā)[1]，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，是定殖于宿主腸道內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中投入微生態(tài)制劑，可明顯增強(qiáng)對(duì)蝦血清的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶活性及抗菌活力和溶菌活力[2-4]。然而，目前用于對(duì)蝦水質(zhì)調(diào)控的微生態(tài)制劑以光合細(xì)菌、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母菌和乳酸菌等為主[5]，針對(duì)水體亞硝態(tài)氮去除的微生物鮮有報(bào)道。

水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的殘余餌料、排泄物、死亡尸體等大量有機(jī)物在微生物的作用下，產(chǎn)生大量氨氮等含氮有害物質(zhì)，氨氮在亞硝化細(xì)菌和光合細(xì)菌作用下轉(zhuǎn)化成亞硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮進(jìn)一步與胺類物質(zhì)結(jié)合，形成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝胺[6]。通常情況下，利用亞硝態(tài)氮的硝酸細(xì)菌為自養(yǎng)細(xì)菌，生長緩慢，造成亞硝態(tài)氮的快速積累，亞硝態(tài)氮的長期蓄積會(huì)直接導(dǎo)致魚、蝦等養(yǎng)殖對(duì)象抗病力的降低，引起各種病原菌的繼發(fā)性侵襲，通常被視作是魚、蝦的致病根源[7]。因此，分離篩選去除亞硝態(tài)氮的異養(yǎng)硝酸細(xì)菌，并應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，對(duì)于快速降低養(yǎng)殖水體中的亞硝態(tài)氮，確保養(yǎng)殖動(dòng)物健康生長，具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)菌株自天津漢沽養(yǎng)蝦后期池水中分離純化得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

C4H6O43 g/L，NaNO20.32 g/L， Na2HPO4·12H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，微量元素(EDTA 0.5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.22 g/L，CaCl20.055 g/L，MnCl2·4H2O 0.051 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.049 g/L，CuSO4·5H2O 0.0157 g/L，CoCl2·6H2O 0.016 g/L) 5 mL/L，pH 7.5。該培養(yǎng)基用于篩選和脫氮試驗(yàn)。

1.1.3 主要儀器

S.SW-CJ-1CU超凈工作臺(tái)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，TGL-16高速冷凍離心機(jī)(湖南長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，QYC-2102C立式雙層小容量恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，T1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，T100 PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)，ChemiDoc XRS型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，HT7700透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離與篩選

500 mL錐形瓶中加入200 mL培養(yǎng)基，接入10 mL養(yǎng)殖水體，置于30 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3 d。取富集培養(yǎng)的樣品1 mL，用稀釋梯度法依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度，從樣品10-3梯度開始分別取0.1 mL 菌液，涂布于培養(yǎng)基平板上，生化培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)，24 h 后，挑取單個(gè)菌落，于相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上純化培養(yǎng)。將純化后的所有菌株分別接種于異養(yǎng)培養(yǎng)基中，170 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)，定期檢測亞硝態(tài)氮含量(亞硝態(tài)氮測定采用重氮—偶氮法[8])，選擇亞硝態(tài)氮去除效果最好的一株作為目的菌株，編號(hào)為LQ1。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 菌株的亞顯微觀察

菌株LQ1經(jīng)過脫水、干燥、鍍膜后用掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.2.2 菌株的部分生理生化特征

對(duì)分離篩選到的菌株按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]方法進(jìn)行葡萄糖、乳糖發(fā)酵，硝酸鹽還原試驗(yàn)，甲基紅試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)。

1.2.2.3 菌株的16S rDNA同源序列分析

按照Invitrogen 試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA，細(xì)菌通用引物8F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物上游8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′；下游1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR體系為50 μL，其中包括：5 μL 10×buffer，4 μL dNTPs，正反引物各1 μL，Taq 酶1 μL，DNA 模板1 μL，37 μL 無菌去離子水。擴(kuò)增程序：94 ℃，預(yù)變性5 min;94 ℃，變性30 s，60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸 2 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，16S rDNA產(chǎn)物委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，利用BLAST軟件，將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中有關(guān)序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.3 最佳脫氮條件的篩選

1.2.3.1 碳氮比對(duì)菌株去除亞硝態(tài)氮的影響

改變培養(yǎng)基中NaNO2的含量，使其碳氮比分別為7、10、13、16、19、22、25，接入5%的菌株LQ1， 30 ℃，130 r/min的搖床中培養(yǎng)，6 h和12 h測定亞硝態(tài)氮含量。

1.2.3.2 初始pH值對(duì)菌株去除亞硝態(tài)氮的影響

分別將培養(yǎng)基的pH調(diào)至3、5、7、9、11，其他方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 溫度對(duì)菌株去除亞硝態(tài)氮的影響

培養(yǎng)基溫度設(shè)置20、25、30、35、40、45 ℃ 6個(gè)梯度，其他方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 脫氮率的計(jì)算

ρB/%=(ρ1-ρ2)/ρ2×100%

式中，ρB為脫氮率，ρ1初始亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度；ρ2一定時(shí)間后亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。分析軟件為SPSS 17.0，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

以亞硝態(tài)氮為唯一氮源的培養(yǎng)基，共篩選到6株去除亞硝態(tài)氮菌株，其中菌株LQ1去除效果最好。

2.2 菌株LQ1的形態(tài)與生理生化特征

2.2.1 菌株LQ1的形態(tài)

菌株LQ1在培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)1 d，觀察到菌落較小，灰白色，周邊光滑圓潤，表面規(guī)則；革蘭氏染色陰性，細(xì)胞呈桿狀，有鞭毛，大小為(2～3) μm×(0.5～1) μm(圖1)。

2.2.2 生理生化特征

菌株LQ1的生理生化特征見表1，該菌株可以發(fā)酵葡萄糖和乳糖，還原硝酸鹽，不能液化明膠，不產(chǎn)生吲哚，甲基紅試驗(yàn)陰性。

圖1 菌株LQ1的亞顯微形態(tài)

鑒定指標(biāo)葡萄糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵硝酸鹽還原甲基紅試驗(yàn)明膠液化吲哚試驗(yàn)鑒定結(jié)果+++---

2.3 菌株LQ1的16S rDNA序列分析

菌株LQ1經(jīng)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果見圖2，16S rDNA 測序，所測菌株的序列通過Blast檢索，并與GenBank中的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA 軟件，以鄰接法繪制16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，經(jīng)16S rDNA 的同源性比較，菌株LQ1與脫氮海洋單胞菌(Oceanimonasdenitrificans)的相似性達(dá)99%。結(jié)合菌株LQ1的菌落形態(tài)、亞顯微形態(tài)和生理生化特征，確定分離到的菌株LQ1為脫氮海洋單胞菌。

2.4 脫氮海洋單胞菌生長曲線的制作

在溫度35 ℃、pH 9.0、碳氮比為22、氯化鈉質(zhì)量濃度15 g/L條件下，將脫氮海洋單胞菌LQ1培養(yǎng)24 h，繪制細(xì)菌生長曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可見，1～3 h期間，細(xì)菌為遲緩期，4～21 h為對(duì)數(shù)生長期，21 h以后為穩(wěn)定期和衰退期。

2.5 脫氮海洋單胞菌去除亞硝態(tài)氮效果

將脫氮海洋單胞菌LQ1接種到培養(yǎng)基中，定期檢測亞硝態(tài)氮含量的變化，結(jié)果見圖5。由圖5可見，隨著時(shí)間的延長，培養(yǎng)體系中亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度逐漸減小，12 h時(shí)，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度達(dá)到0.73 mg/L，去除率達(dá)98.69%，可見脫氧海洋單胞菌LQ1具有很好的亞硝態(tài)氮去除效果。

圖2 菌株LQ1的16S rDNA電泳圖譜

圖3 基于16S rDNA 序列同源性的菌株LQ1 的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 脫氮海洋單胞菌LQ1生長曲線

圖5 脫氮海洋單胞菌LQ1去除亞硝態(tài)氮效果

2.6 碳氮比、pH和溫度對(duì)脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮率的影響

2.6.1 碳氮比對(duì)脫氮率的影響

設(shè)置7個(gè)碳氮比梯度，研究其對(duì)菌株脫氮率的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可見，試驗(yàn)6 h和12 h出現(xiàn)了類似的結(jié)果，均是碳氮比為7時(shí)，脫氮率最低，而后逐漸增加；當(dāng)碳氮比達(dá)到16時(shí)，脫氮率達(dá)到最大，為99.22%，而后隨著碳氮比的增加，脫氮率略微降低，但幅度很小，說明碳氮比為16時(shí)，脫氮海洋單胞菌LQ1的脫氮效果最好。

圖6 碳氮比對(duì)脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮率的影響

2.6.2 pH值對(duì)脫氮率的影響

將脫氮海洋單胞菌LQ1接入到不同初始pH值的培養(yǎng)基中，其脫氮率結(jié)果見圖7。由圖7可見，隨著pH的增加，菌株的脫氮率逐漸增大，pH為9時(shí)，脫氮率最大，12 h脫氮率達(dá)98.73%，而后隨著pH的增加，脫氮率逐漸減小。可見脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮適宜的初始pH為9。

圖7 pH對(duì)脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮率的影響

2.6.3 溫度對(duì)菌株脫氮率的影響

將脫氮海洋單胞菌LQ1接入培養(yǎng)基，置于不同溫度下培養(yǎng)，分別于6 h和12 h測定亞硝態(tài)氮含量，并計(jì)算脫氮率，結(jié)果見圖8。由圖8 可見，隨著溫度的升高，菌株的脫氮率逐漸增大，當(dāng)溫度增至35 ℃時(shí)，菌株的脫氮率最大，達(dá)98.06%，而后隨著溫度的升高，菌株的脫氮率出現(xiàn)降低的趨勢，但減幅緩慢，說明脫氮海洋單胞菌LQ1的脫氮適宜在較高溫度下進(jìn)行。

圖8 溫度對(duì)脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮率的影響

3 討 論

傳統(tǒng)意義上的硝化作用指自養(yǎng)硝化。雖然自養(yǎng)硝化菌在水體氮循環(huán)中起到非常重要的作用[10]，但自養(yǎng)硝化細(xì)菌分離困難、生長速度慢、生物量小、代時(shí)長及對(duì)環(huán)境因子敏感等特點(diǎn)[11]在一定程度上阻礙了硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。異養(yǎng)硝化細(xì)菌以其生長速度快、代時(shí)短及對(duì)環(huán)境因子遲鈍等特點(diǎn)，引起了人們的極大關(guān)注。研究者分離鑒定出來了一些異養(yǎng)硝化細(xì)菌[12-16]，但自水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中分離鑒定異養(yǎng)硝化細(xì)菌還較少見，研究異養(yǎng)硝化細(xì)菌的脫氮機(jī)理也不多。芮傳芳等[17]從巢湖底泥中分離出一株具有氨氮轉(zhuǎn)化活性的異養(yǎng)硝化細(xì)菌，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)；王李寶等[18]自江蘇通州、海安和呂四地區(qū)的養(yǎng)殖池塘淺層底泥中分離得到4株具明顯硝化活性的異養(yǎng)硝化細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)和生理生化研究，初步鑒定為芽孢桿菌。崔青曼等[19]從對(duì)蝦底泥中分離純化出一株高效去除亞硝態(tài)氮的細(xì)菌，鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)；袁春營等[20]進(jìn)行了魯氏不動(dòng)桿菌(A.lwoffii)的鹽度馴化與亞硝態(tài)氮去除機(jī)理研究。鄭宗林等[21]從福州市閩侯縣高岐工業(yè)園區(qū)某工廠排污口淤泥及垃圾滲出液中分離出一株反硝化聚磷菌和一株高效聚磷菌，經(jīng)生理生化特征分析并結(jié)合16S rRNA編碼基因序列分析對(duì)兩株菌進(jìn)行鑒定，二者分別為類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)和瓊氏不動(dòng)桿菌(A.junii)。本次從對(duì)蝦養(yǎng)殖后期水體中分離一株硝化細(xì)菌，具有良好的亞硝酸氮去除效果，并確定了它的最佳脫氮條件，下一步擬進(jìn)行脫氮海洋單胞菌LQ1的脫氮機(jī)理研究，同時(shí)與其他微生物配伍，制備對(duì)蝦專用微生態(tài)制劑，以期降低對(duì)蝦養(yǎng)殖后期水體中的亞硝態(tài)氮含量，確保對(duì)蝦健康生長。