陳星燦，王 磊，相興偉，周宇芳，邵慶均，鄭 斌，肖金星

( 1.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021； 2.舟山市定海區(qū)人民政府馬岙街道辦事處，浙江 舟山 316000； 3.浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 4.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江 舟山 316021 )

硒為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和含硒tRNA的組成成分，能防止過(guò)氧化物在細(xì)胞內(nèi)蓄積，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，也能促進(jìn)某些mRNA翻譯蛋白質(zhì)的過(guò)程，提高機(jī)體的免疫力與抗病力，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[1-2]，是水產(chǎn)動(dòng)物正常生長(zhǎng)和生理功能所必需的重要微量元素，在水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)研究中逐漸受到重視。有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)硒的需求量已有諸多研究。萬(wàn)敏等[3]的研究表明，當(dāng)飼料中含有50 IU/kg的維生素E時(shí)，添加約0.6 mg/kg的硒能使皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)血清中的抗氧化酶系統(tǒng)達(dá)到相對(duì)平衡，使動(dòng)物能有效地抵抗氧化損害。Lin等[4]以質(zhì)量增加率和硒的留存率為指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinephelusmalabaricus)幼魚(yú)對(duì)飼料中硒的最適需求量為0.7 mg/kg。從提高免疫力和抗病力的角度出發(fā)，張琴等[5]建議仿刺參(Apostichopusjaponicus)飼料中同時(shí)添加硒酵母600 mg/kg和維生素E 250 mg/kg。Lin等[6]研究了飼料中添加有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒對(duì)石斑魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)和肉質(zhì)等的影響，發(fā)現(xiàn)石斑魚(yú)幼魚(yú)對(duì)硒代蛋氨酸和亞硒酸鈉的最適需求量分別為0.98 mg/kg和0.9 mg/kg。

常見(jiàn)的硒分為有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒兩種形式，用于飼料中的無(wú)機(jī)硒主要為亞硒酸鈉，有機(jī)硒主要為硒化多糖和硒代蛋氨酸。不同化學(xué)形式硒的生物利用率明顯不同[7-8]。眾多研究表明，有機(jī)硒比無(wú)機(jī)硒具有更高的生物利用率，例如更高的硒保留率、消化率以及更低的毒性[9-10]。硒化多糖作為一種有機(jī)硒化合物，兼有多糖與硒二者的活性，為生物體內(nèi)無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的有效形式之一，生物活性普遍高于多糖和硒，更易于為機(jī)體吸收和利用[11]。硒化多糖可以作為增強(qiáng)適應(yīng)性免疫性能的潛力含硒膳食補(bǔ)充劑[12]。

黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)是我國(guó)東南沿海地區(qū)及日本、韓國(guó)、東南亞等國(guó)家和地區(qū)海水養(yǎng)殖的名貴經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[13-14]。目前，關(guān)于黑鯛對(duì)蛋白和氨基酸的需求量、飼料中魚(yú)粉替代蛋白源開(kāi)發(fā)等已有研究[15-17]，但關(guān)于黑鯛對(duì)硒的利用研究較少，且針對(duì)黑鯛對(duì)有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒吸收及利用比較的研究更少。筆者研究了飼料中添加外源有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、體組成及血清免疫指標(biāo)的影響，旨在為黑鯛飼料免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)試驗(yàn)

黑鯛幼魚(yú)由浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗(yàn)場(chǎng)提供。經(jīng)過(guò)14 d的暫養(yǎng)后，停飼1 d，挑選體質(zhì)健康、大小均勻、初始體質(zhì)量為(13.00±0.20) g的黑鯛幼魚(yú)隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾，放入容積為310 L(水體260 L)的玻璃纖維缸內(nèi)，微流水式飼養(yǎng)8周。海水經(jīng)沉淀、過(guò)濾后使用，流速控制在2 L/min，平均水溫為(27±1) ℃，鹽度26～29，溶解氧>5.0 mg/L。養(yǎng)殖期間，每日8:00和16:00投喂至飽食狀態(tài)，記錄各試驗(yàn)組投餌量和死亡率。

1.2 飼料配方

基于前期黑鯛飼料營(yíng)養(yǎng)需求研究結(jié)果，設(shè)計(jì)試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料(對(duì)照組)蛋白水平為41.57%，脂肪為13.63%。在基礎(chǔ)飼料中分別添加2.35 mg/kg的硒化多糖和0.88 mg/kg的亞硒酸鈉，使試驗(yàn)飼料中外源硒的添加量均為0.4 mg/kg。硒化多糖為自制，通過(guò)殼聚糖與亞硒酸鈉螯合而成，分子量為50 ku，硒含量的實(shí)測(cè)值為17%。亞硒酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，硒含量≥63.8%。飼料原料粉碎過(guò)80目篩，充分混合均勻后，制成粒徑為2.5 mm的硬顆粒飼料，用空調(diào)抽濕、風(fēng)扇干燥72 h，置于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆肹15]。各組試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分值見(jiàn)表1。

1.3 樣品采集及分析測(cè)定

56 d養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將試驗(yàn)魚(yú)饑餓24 h，用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽60 mg/L麻醉，記錄每缸試驗(yàn)魚(yú)數(shù)目，測(cè)量體長(zhǎng)、體質(zhì)量。每缸取3尾魚(yú)用作全魚(yú)分析。剩余試驗(yàn)魚(yú)尾靜脈取血，置于離心管中，4 ℃靜置2 h，3000 r/min 離心15 min，取上層血清，于-20 ℃冰箱中保存；取血后將試驗(yàn)魚(yú)置于冰盤上解剖，去除魚(yú)皮后，取兩側(cè)側(cè)線上的背肌，將樣品置于-20 ℃的冰箱中保存；取出試驗(yàn)魚(yú)內(nèi)臟團(tuán)，剝離其上附著的脂肪組織，將肝臟稱量質(zhì)量后，置于-20 ℃的冰箱中保存，待分析用。

全魚(yú)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定方法如下：粗蛋白采用GB 6432—94方法；粗脂肪采用GB 6433—94的方法；水分采用GB 6435—86的方法；灰分采用GB 6438—92的方法。血清中血清免疫球蛋白M、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4的活力采用南京建成試劑盒檢測(cè)。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算方法

成活率/%=n2/n1×100%

特定生長(zhǎng)率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

肝體比/%=m3/m×100%

肥滿度=m/L3×100

式中，n1為試驗(yàn)初始時(shí)魚(yú)的尾數(shù)，n2為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚(yú)的尾數(shù)，m1為試驗(yàn)初始時(shí)魚(yú)的平均體質(zhì)量(g)，m2為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚(yú)的平均體質(zhì)量(g)，m3為試驗(yàn)魚(yú)的肝臟質(zhì)量(g)，m為試驗(yàn)魚(yú)體質(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)時(shí)間(d)，L為試驗(yàn)魚(yú)體長(zhǎng)(cm)。

表1 試驗(yàn)飼料原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分含量 g/kg

注：1.復(fù)合維生素(mg/kg)：α-生育酚，20；二硫氫酸鈉維生素K，5；維生素B1，5；泛酸鈣，10；煙堿酸，100；維生素B6，5；葉酸，2；維生素B12，0.05；生物素，0.5；氨基苯酸，50；肌醇，500；氯化膽堿，500；維生素C，150；維生素A，10 000 IU/kg；維生素D3，2000 IU/kg. 2.復(fù)合礦物鹽(mg/kg)：Na2SiO3, 0.4; CaCO3, 544.9; NaH2PO4·H2O, 200; KH2PO4, 200; MgSO4·7H2O, 10; MnSO4·H2O, 4; CuCl2·2H2O, 2; ZnSO4·7H2O, 12; FeSO4·7H2O, 12; NaCl, 12; KI, 0.1; CoCl2·6H2O, 0.1; Na2MoO4·2H2O, 0.5; AlCl3·6H2O, 1; KF, 1.

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析后采用Duncan多重比較檢驗(yàn)，顯著水平為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)生長(zhǎng)性能及形體指標(biāo)的影響

經(jīng)過(guò)8周的飼養(yǎng)試驗(yàn)，各組黑鯛幼魚(yú)成活率均超過(guò)98%，飼料中添加硒化多糖和亞硒酸鈉對(duì)黑鯛幼魚(yú)的成活率、肝體比和肥滿度無(wú)顯著影響(P>0.05)，而添加硒化多糖和亞硒酸鈉的試驗(yàn)組黑鯛幼魚(yú)的特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；添加硒化多糖組黑鯛幼魚(yú)的特定生長(zhǎng)率顯著高于添加亞硒酸鈉組(P<0.05)(表2)。

2.2 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)全魚(yú)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)組成的影響

飼料中添加硒化多糖和亞硒酸鈉組黑鯛幼魚(yú)全魚(yú)的蛋白、脂肪、水分以及灰分含量與對(duì)照組相比，均差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2.3 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響

飼料中添加硒化多糖和亞硒酸鈉組黑鯛幼魚(yú)血清免疫球蛋白M、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4的含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且添加硒化多糖組黑鯛幼魚(yú)的血清免疫球蛋白M、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4的含量顯著高于添加亞硒酸鈉組(P<0.05)(表4)。

表2 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)生長(zhǎng)性能及形體指標(biāo)的影響

注：結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)，同列肩注不同字母者，表示差異顯著(P<0.05)，下同.

表3 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)全魚(yú)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)組成的影響 %

表4 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響

2.4 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)肌肉和肝臟組織硒含量的影響

飼料中添加硒化多糖和亞硒酸鈉組黑鯛幼魚(yú)肌肉和肝臟組織中硒含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，添加硒化多糖的黑鯛幼魚(yú)肌肉和肝臟組織硒含量顯著高于添加亞硒酸鈉組(P<0.05)，肝臟中硒含量顯著高于肌肉中硒含量(P<0.05)(表5)。

表5 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)肌肉和肝臟組織硒含量的影響mg/kg

3 討 論

3.1 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

硒是魚(yú)類保持正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，缺硒會(huì)抑制魚(yú)體生長(zhǎng)[18]。目前有關(guān)添加外源硒對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的促生長(zhǎng)效果已開(kāi)展諸多研究。王安利等[19]研究表明，飼料中添加外源硒可以顯著促進(jìn)中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)的生長(zhǎng)。華雪銘等[20]在飼料中添加0.3%、0.6%和1.2%的硒酵母，使異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)體質(zhì)量增加率顯著高于對(duì)照組。Lin等[4]研究表明，飼料中添加適量的硒代蛋氨酸，石斑魚(yú)幼魚(yú)的體質(zhì)量增加率顯著高于對(duì)照組，硒水平為0.77 mg/kg時(shí)達(dá)最大值。梁萌青等[21]研究表明，在飼料中添加亞硒酸鈉可以顯著提高花鱸(Lateolabraxjaponicus)的特定生長(zhǎng)率，硒水平為0.4 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值。許友卿等[22]在鳡魚(yú)(Elopichthysbambusa)濕顆粒飼料中添加0～1.2 mg/kg的酵母硒，當(dāng)酵母硒的添加量為0.6 mg/kg時(shí)，鳡魚(yú)的質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率達(dá)到最大值。

3.2 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響

魚(yú)類的免疫系統(tǒng)執(zhí)行免疫功能時(shí)受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控[31]。免疫球蛋白是具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白，也是魚(yú)類免疫系統(tǒng)的重要組成部分。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為硬骨魚(yú)類只有1種免疫球蛋白，類似于哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白M[32]，但近年來(lái)的研究結(jié)果表明，硬骨魚(yú)可能有4類免疫球蛋白，分別是免疫球蛋白M[33]、免疫球蛋白D[34]、免疫球蛋白Z/T[35-36]以及免疫球蛋白M-Z[37]。Feng等[38]研究表明，B族維生素能夠通過(guò)提高建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)血清中嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)抗體效價(jià)和免疫球蛋白M水平從而增強(qiáng)其特異性免疫力。本試驗(yàn)中，飼料中添加硒含量為0.4 mg/kg的硒化多糖和亞硒酸鈉組黑鯛幼魚(yú)血清免疫球蛋白M含量顯著高于對(duì)照組；添加硒化多糖組顯著高于添加亞硒酸鈉組。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加外源硒可以提高黑鯛幼魚(yú)免疫球蛋白M水平，增強(qiáng)其特異性免疫，且有機(jī)硒的效果優(yōu)于無(wú)機(jī)硒。

魚(yú)類補(bǔ)體大約由30余種蛋白裂解酶、酶抑制因子和受體構(gòu)成，是機(jī)體內(nèi)最為復(fù)雜的限制性蛋白溶解系統(tǒng)[39]。許多研究表明，魚(yú)類補(bǔ)體直接參與機(jī)體防御，其生物學(xué)活性影響機(jī)體抵抗微生物的能力、免疫反應(yīng)細(xì)胞間的通訊聯(lián)系、免疫復(fù)合物的形成和持續(xù)時(shí)間等[40]。魚(yú)類補(bǔ)體或免疫球蛋白對(duì)外界病原微生物的調(diào)理作用導(dǎo)致吞噬細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng)。虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和鰻鱺(Anguillajaponica)補(bǔ)體激活后能產(chǎn)生導(dǎo)致白細(xì)胞發(fā)生趨化性的因子[41]，虹鱒的補(bǔ)體C5a也可引起頭腎細(xì)胞的呼吸爆發(fā)[42]。補(bǔ)體缺失則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的非特異性免疫能力下降[43-44]。血清中不存在補(bǔ)體溶血活性的虹鱒和馬蘇大麻哈魚(yú)(Oncorhynchusmasou)幼魚(yú)更易感染傳染性造血器官壞死病和傳染性胰壞死病[45]。彭耀宗等[46]研究發(fā)現(xiàn)，攝食鹽酸小檗堿的草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)血清中補(bǔ)體C3含量和肝臟補(bǔ)體C3 mRNA表達(dá)量均顯著增加，存活率顯著高于對(duì)照組。本試驗(yàn)中，飼料中添加硒含量為0.4 mg/kg的硒化多糖和亞硒酸鈉時(shí)，黑鯛幼魚(yú)血清補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4含量顯著高于對(duì)照組，添加硒化多糖組顯著高于添加亞硒酸鈉組，表明添加外源硒可以提高黑鯛幼魚(yú)血清補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4水平，增強(qiáng)其非特異性免疫，且有機(jī)硒的效果優(yōu)于無(wú)機(jī)硒。

3.3 外源硒對(duì)黑鯛幼魚(yú)體內(nèi)硒沉積的影響

4 小 結(jié)

本試驗(yàn)表明，在基礎(chǔ)飼料中分別添加硒含量為0.4 mg/kg的硒化多糖和亞硒酸鈉，黑鯛幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能、血清免疫活性以及硒在體內(nèi)的沉積率顯著提高，且有機(jī)硒生物利用率顯著高于無(wú)機(jī)硒。關(guān)于黑鯛對(duì)有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒的最適需求量需要進(jìn)一步研究。