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        我國(guó)華北區(qū)甜菜苗期未知葉斑病害的診斷鑒定

        2018-09-19 09:20:12李文兵白進(jìn)玲張宗英吳學(xué)宏韓成貴
        中國(guó)糖料 2018年5期
        關(guān)鍵詞:鏈格甜菜苗期

        李文兵,白進(jìn)玲,王 穎,張宗英,吳學(xué)宏,韓成貴

        (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系,北京100193)

        甜菜苗期主要病害是立枯病[1]。2014年4月底5月初,我國(guó)河北省和內(nèi)蒙古兩地大面積甜菜種植區(qū)苗期甜菜葉片上出現(xiàn)一種新的葉部枯斑病害,癥狀為子葉和真葉上出現(xiàn)枯斑,中心黃白色,有紫色暈圈,一般在育苗棚滴水處形成發(fā)病中心(如圖1)。河北省張家口地區(qū)張北糖廠紙筒育苗面積14萬(wàn)畝(9330 hm2)中約2萬(wàn)畝(1330 hm2)發(fā)生此病害,內(nèi)蒙古集寧地區(qū)商都、察右前旗和赤峰地區(qū)林西等地也均有發(fā)生。該未知的苗期病害會(huì)給甜菜的生產(chǎn)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。糖廠技術(shù)人員認(rèn)為是苗期褐斑病,筆者初步認(rèn)為是真菌病害但不一定是褐斑病菌所致。因此,有必要通過(guò)室內(nèi)柯赫氏法則試驗(yàn)盡早診斷出該未知病害及鑒定其病原,為有效控制此類(lèi)病害、減輕甜菜損失提供理論指導(dǎo)。

        圖1 苗期甜菜未知葉斑病害葉片癥狀

        1 材料與方法

        1.1 材料

        供試甜菜:采自?xún)?nèi)蒙古林西地區(qū)和河北省張北縣地區(qū)未知病害的苗期甜菜。

        供試培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),用于病原菌的分離、培養(yǎng)、保存[2]。

        1.2 方法

        1.2.1 未知病原分離與保存及病原鑒定 在采自我國(guó)不同地點(diǎn)甜菜病葉的病健交界處取5 mm×5 mm的病組織,3%次氯酸鈉消毒3~5 min,無(wú)菌水沖洗3次后晾干接種在PDA培養(yǎng)基上,25℃黑暗培養(yǎng)并純化,將純化后的病原物置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。主要依?jù)形態(tài)和分子序列進(jìn)行鑒定。DNA提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序等參照林杰等方法[2-6]。

        1.2.2 接種實(shí)驗(yàn) 采用無(wú)傷接種的葉片涂抹法進(jìn)行致病性試驗(yàn),供試甜菜品種甜研309。方法如下:1)每株菌需要品種為甜研309健康生長(zhǎng)3~4周的葉片15片,置于發(fā)芽盒中(每盒5片葉子),事先在發(fā)芽盒內(nèi)墊上合適大小的滅菌濾紙,并噴灑足量滅菌水用于保濕;2)在每個(gè)葉片上下兩端均接種20μL濃度為106個(gè)/mL孢子懸浮液(接種處要遠(yuǎn)離葉脈),同時(shí)設(shè)置無(wú)菌水處理的葉片作為對(duì)照;3)接種完畢用保鮮膜將發(fā)芽盒封好,再放入25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),7 d后觀察葉片的發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)結(jié)果[2]。

        2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

        2.1 直接提取甜菜病葉DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)結(jié)果

        分別提取甜菜病葉DNA直接PCR檢測(cè)結(jié)果,檢測(cè)結(jié)果表明甜菜褐斑病菌的特異引物不能擴(kuò)增出特異條帶,而用真菌檢測(cè)通用ITS引物可以擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(圖2)?;诖藱z測(cè)結(jié)果可知:該苗期病害并非甜菜褐斑病,可以初步確定是一種真菌病害。

        2.2 病原菌分離結(jié)果

        取甜菜病健交界處組織進(jìn)行分離,并逐步純化獲得純培養(yǎng)物(3次重復(fù)以上),5個(gè)分離物(林西、張北)在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)菌呈灰色毛絨狀均勻分布(圖3和4)。

        圖2 不同引物PCR檢測(cè)病樣品結(jié)果

        圖3 林西病樣分離的病原菌菌落正反面

        圖4 張北病樣分離的病原菌菌落正反面

        2.3 提取分離菌株菌絲的DNA檢測(cè)結(jié)果

        2.3.1 利用真菌檢測(cè)通用引物ITS1及ITS4的檢測(cè)結(jié)果 刮取上述5個(gè)分離物(L1、L2、Z1、Z2、Z3)菌絲提取DNA,利用真菌通用引物ITS1和ITS4檢測(cè),PCR檢測(cè)結(jié)果得到一條長(zhǎng)541 bp單一條帶(圖5)。

        經(jīng)過(guò)對(duì)5個(gè)分離物擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接轉(zhuǎn)化,各挑取8個(gè)克隆,測(cè)序結(jié)果比對(duì)序列相同。NCBI比對(duì)結(jié)果為:無(wú)論是直接提取病葉DNA測(cè)序還是分離的病原菌提取菌落DNA測(cè)序得到的序列相同,比對(duì)結(jié)果為Alternaria tenuissima(極細(xì)鏈格孢菌)。

        2.3.2 利用H3-1a/H3-1b引物檢測(cè) 利用組蛋白3基因部分編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)的引物H3-1a和H3-1b擴(kuò)增分離物菌絲DNA結(jié)果得到一條600 bp左右單一條帶。對(duì)照為一株已經(jīng)鑒定的鏈格孢菌?;厥諟y(cè)序結(jié)果同真菌通用引物檢測(cè)結(jié)果一致,均為極細(xì)鏈格孢菌(Alternaria tenuissima),見(jiàn)圖6。

        圖5 真菌通用引物ITS1及ITS4 PCR檢測(cè)分離菌株結(jié)果L:代表內(nèi)蒙林西分離物;Z:代表河北張北分離物

        圖6 H3-1a/H3-1b引物PCR檢測(cè)結(jié)果

        2.4 分離物回接試驗(yàn)結(jié)果

        根據(jù)柯赫氏法則,將分離得到的病原物回接到苗期甜菜葉片上,出現(xiàn)了相同的癥狀,接種成功率為100%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果一致,表明分離的菌株確實(shí)是引起這種病害的病原物(圖7)。將回接成功的甜菜病葉,取病健交界處組織進(jìn)行分離、鑒定,同樣再次獲得了該病原菌,完成了柯赫氏法則全部試驗(yàn)(圖8)。

        圖7 病原菌回接甜菜(品種為甜研309)

        圖8 從接種發(fā)病葉片再分離病原菌

        3 結(jié)論與討論

        通過(guò)對(duì)張北和林西甜菜苗期發(fā)生未知葉部病害樣品進(jìn)行病葉提取DNA直接PCR檢測(cè)、病原菌分離、鑒定和回接試驗(yàn),進(jìn)行了準(zhǔn)確診斷和鑒定。提取甜菜苗期葉部病害樣和分離的病原菌株菌絲DNA,利用真菌檢測(cè)的通用引物ITS1及ITS4和根據(jù)組蛋白3基因部分編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)的H3-1a和H3-1b引物檢測(cè)結(jié)果得到一條單一條帶,測(cè)定序列,NCBI比對(duì)結(jié)果表明,無(wú)論是直接提取病葉DNA測(cè)序還是分離的病原菌提取菌落DNA測(cè)序得到的序列相同,結(jié)合分離菌落形態(tài),對(duì)該病害的病原菌進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定,同時(shí)進(jìn)行病原菌回接實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)能引起甜菜苗期葉斑病害。首次明確了這種甜菜苗期出現(xiàn)的未知葉斑病害為一種真菌病害,其病原為極細(xì)鏈格孢菌(Alternaria tenuissima),排除了褐斑病菌危害的可能性,解決了生產(chǎn)中的難題,為今后再出現(xiàn)此種病害的診斷和尋求有效控制措施提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

        極細(xì)鏈格孢菌是一種重要的植物病原真菌,其對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng),寄主范圍廣泛[7],不僅能侵染柚、柑橘、杏、葡萄、臍橙、檸檬、草莓等水果,還可在花生、小麥、向日葵、棉花、大豆、辣椒、豇豆及綠穗莧等多種植物上寄生,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[8]。2014年黑龍江大學(xué)在紅柴胡(一種雜草)上報(bào)道過(guò)極細(xì)鏈格孢菌類(lèi)似序列。由于我們采集的樣品有限,因此,不排除有其他鏈格飽菌種類(lèi)可以引起此病的可能性。

        我們?cè)谡{(diào)查時(shí)初步診斷為真菌病害,并給出了初步防治建議。對(duì)于發(fā)生較重的苗床可以用防治褐斑病的廣譜性藥劑苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑等進(jìn)行噴藥控制。如果苗源緊張,新葉和根發(fā)育正常的苗子可以移栽。極細(xì)鏈格孢菌通過(guò)我們的準(zhǔn)確診斷和病原鑒定,可以更有針對(duì)性地進(jìn)行病害發(fā)生分布、發(fā)生因素分析和有效控制技術(shù)研發(fā)。

        致謝:博天糖業(yè)股份有限公司張海和高鴻斌先生,荷蘭安地公司北京代表處的秦樹(shù)才先生等協(xié)助采集甜菜樣品;內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院張惠忠研究員提供甜菜品種。

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