周鋒祺，謝慶平，樓 寶，孟祥磊，何 雪，孫 毅，詹 煒，陳睿毅，劉 峰，王立改，徐冬冬

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021；2.嵊泗縣海洋與漁業(yè)局，浙江嵊泗 202450）

魚(yú)類(lèi)生存的水域環(huán)境分布廣泛、自身種類(lèi)豐富，其性別決定也具有多樣性[1]。同時(shí)，魚(yú)類(lèi)的性別也具有高度的可塑性[2]，性別除了由遺傳因素決定外，還可以通過(guò)環(huán)境因素產(chǎn)生影響，這些因素包括類(lèi)固醇激素、溫度、密度等[3-4]。類(lèi)固醇激素對(duì)性別影響的研究中，以雌激素（雌二醇17β-estradiol，E2）較多，雌二醇是一種常用的誘導(dǎo)雌性化的類(lèi)固醇激素，即使在低濃度下也具有高效的雌激素效應(yīng)[5]，因此被認(rèn)為是性別決定過(guò)程中的關(guān)鍵因子。例如：方永強(qiáng)等[6]使用E2濃度為10 mg/kg誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，鯔魚(yú)Mugil cephalus有90%以上的雌性率；張曉彥等[7]通過(guò)浸浴E2的方式，對(duì)半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis的處理中，1 μg/L和30 μg/L的雌性率分別為74%和97%。誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)雌性化的方法通常有投喂、浸浴、注射和埋植雌激素，這些方法都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生性逆轉(zhuǎn)的雌魚(yú)，但過(guò)量的激素處理也會(huì)影響其生長(zhǎng)發(fā)育，不足又會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)不成功。

小黃魚(yú)Larimichthys polyactis俗稱(chēng)厚鱗仔、黃花魚(yú)、小黃瓜，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)魚(yú)類(lèi)之一，為渤、黃、東海群眾及機(jī)輪漁業(yè)的主要捕撈對(duì)象[8]。由于過(guò)度捕撈，環(huán)境污染，氣候環(huán)境變化等原因，小黃魚(yú)捕撈量急劇下降，捕獲的小黃魚(yú)個(gè)體表現(xiàn)出日趨小型化、性成熟提前的現(xiàn)象，種質(zhì)資源退化相當(dāng)嚴(yán)重，已經(jīng)無(wú)法滿足人們的消費(fèi)需求[9-11]。2000年，在黃海南部捕撈野生小黃魚(yú)的雌雄性比平均為1:2.7；且形態(tài)上雌性的體形比雄性稍大[12]。2015年，小黃魚(yú)全人工繁殖技術(shù)取得成功[13]，人工養(yǎng)殖試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)雌魚(yú)體型比雄魚(yú)偏大，更具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，實(shí)現(xiàn)小黃魚(yú)全雌化育種成為了現(xiàn)有階段的主要目標(biāo)，本研究用不同濃度雌激素E2誘導(dǎo)孵化后17 d的小黃魚(yú)，通過(guò)常規(guī)測(cè)量及組織切片觀察的方法研究該藥物對(duì)小黃魚(yú)生長(zhǎng)和性腺發(fā)育的影響，為研究小黃魚(yú)性別分化的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)時(shí)間從2017年5月開(kāi)始，在浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒漁業(yè)科技島海水魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)魚(yú)苗為浙江省海洋水產(chǎn)研究所自主人工繁育的F3代魚(yú)苗，在500 L藍(lán)色玻璃鋼水缸中孵化、養(yǎng)殖。實(shí)驗(yàn)所用海水為經(jīng)高位池沉淀和砂濾池過(guò)濾處理之后的海水，由于小黃魚(yú)人工自然水溫養(yǎng)殖環(huán)境下雌雄性比近似為1:1，因此本實(shí)驗(yàn)水溫采用自然水溫，實(shí)驗(yàn)期間水溫范圍為19～27℃，鹽度29左右，供氧充足。實(shí)驗(yàn)前期投喂輪蟲(chóng)、豐年蟲(chóng)和橈足類(lèi)，孵化后15 d開(kāi)始投喂配合飼料，每日4次，定時(shí)、飽食。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品處理

實(shí)驗(yàn)用藥品采用浸浴的方式，即直接將配置好濃度的藥品加入養(yǎng)殖缸體中。本研究E2處理魚(yú)的浸浴液的配制是先將純度為99%的E2粉末藥品（Sigma，德國(guó)）用95%乙醇溶解，配置成4 mg/mL的浸浴液母液，并避光保存。設(shè)置 3 個(gè)浸浴實(shí)驗(yàn)組，浸浴濃度分別為 1（E1）、10（E10）、50（E50）μg/L；即分別在養(yǎng)殖缸體400 L水中分別直接加入0.1、1和5 mL浸浴液母液，同時(shí)設(shè)置2個(gè)對(duì)照組：95%乙醇組C（95%）和正常養(yǎng)殖組C（0，無(wú)任何添加）。在小黃魚(yú)孵化17 d時(shí)開(kāi)始進(jìn)行浸浴實(shí)驗(yàn)，按實(shí)驗(yàn)濃度梯度1、10和50 μg/L分別于水缸中浸浴，C（95%）按照E2 50 μg/L的添加量，加入同等體積5 mL 95%乙醇。每日斷水浸浴2 h，浸浴后充分換水并開(kāi)啟流水，保證藥物在水體中無(wú)殘留，持續(xù)60 d。分別在浸浴處理20、40和60 d時(shí)測(cè)量體長(zhǎng)（精確到0.1 cm）、體重（精確到0.01 g）、性腺重等數(shù)據(jù)并進(jìn)行性腺取材。20、40和60 d C（0）數(shù)據(jù)取自同期水泥池人工繁育魚(yú)苗。

1.3 組織切片觀察

性腺組織用1:15以上體積的波恩氏液固定過(guò)夜，石蠟包埋性腺，梯度乙醇脫水：75%乙醇3次，每次5 min；80%乙醇 1次，2 min；90%乙醇 1次，2 min；95%乙醇 1次，2 min；100%乙醇 3次，每次 2 min；乙醇二甲苯混合液（V:V=1:1）1次，10 min。二甲苯透明：二甲苯I 1次，時(shí)間隨材料大小變動(dòng)，材料越大時(shí)間越長(zhǎng)；二甲苯II 1次，時(shí)間隨材料大小變動(dòng)，直至材料透明。浸臘：二甲苯石蠟混合液（V:V=1:1）1 h；石蠟2 h；包埋：材料整齊擺放在平皿內(nèi)，將液體石蠟倒入平皿，保證石蠟?zāi)毯罂梢越](méi)材料，水平室溫放置，待其凝固后4℃保存。切片采用橫切，厚度為5 μm。使用RM2245切片機(jī)（萊卡，德國(guó)）。

1.4 H.E（蘇木精-伊紅）染色

對(duì)材料進(jìn)行石蠟切片HE染色，用于觀察性腺組織結(jié)構(gòu)，步驟如下：二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水至75%乙醇后，蘇木精染色：蘇木精，10 s左右；自來(lái)水反藍(lán)：流水沖洗，15 min；超純水，2 min；酸水分色（可不用），10 s左右；梯度乙醇脫水：70%乙醇，2 min；80%乙醇，2 min；95%乙醇，2 min；伊紅染色，依情況而定30～60 s；95%乙醇沖洗，2 次；100%乙醇脫水，2 min；二甲苯透明：1/2 二甲苯+1/2 乙醇，10 min；二甲苯 I，10 min；二甲苯Ⅱ，10 min；中性樹(shù)膠封片。通過(guò)Carl Zeiss Axio Imager A2（蔡司，德國(guó)）顯微鏡拍照，觀測(cè)性腺組織的結(jié)構(gòu)和發(fā)育狀況，并判斷性別。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，單因素方差分析（One-Way ANOVA）跟隨Duncan氏檢驗(yàn)各生長(zhǎng)參數(shù)的顯著性水平，P＜0.05為顯著。

數(shù)據(jù)中性腺成熟系數(shù)（Gonadosomatic index，GSI）的計(jì)算公式為：（性腺重/體重）×100%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 E2浸浴對(duì)小黃魚(yú)早期生長(zhǎng)發(fā)育的影響

采用不同濃度的雌激素E2（1、10和50 μg/L）對(duì)孵化后17 d的小黃魚(yú)進(jìn)行持續(xù)60 d浸浴，結(jié)果表明，隨著浸浴激素濃度的升高，3種不同濃度浸浴組與對(duì)照組C（95%）、C（0）相比，小黃魚(yú)的體型呈減小趨勢(shì)（圖1a）。采集并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各實(shí)驗(yàn)組體長(zhǎng)與體重，結(jié)果顯示，在20 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組組間在體長(zhǎng)和體重上均沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），對(duì)照組 C（95%）和 C（0）高于各實(shí)驗(yàn)組且有顯著性差異（P＜0.05）；在 40 d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組組間在體長(zhǎng)上沒(méi)有顯著性差異，但體重方面，E50顯著性低于E10與對(duì)照組C（95%）、C（0），但與E1沒(méi)有顯著性差異，E10與C（95%）、C（0）無(wú)顯著性差異，且顯著高于E1與E50。在60 d時(shí)，小黃魚(yú)E10與E50相比體長(zhǎng)和體重均無(wú)顯著性差異，且兩者顯著低于E1與對(duì)照組C（95%）、C（0），E1與對(duì)照組相比，體長(zhǎng)與體重均顯著低于對(duì)照組C（95%）、C（0），兩個(gè)對(duì)照組之間無(wú)差異（圖1b）。

圖1 不同浸浴濃度雌激素（E2）對(duì)小黃魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響Fig.1 Effects of different concentrations of estrogen （E2）on the growth of L.polyactis

2.2 E2浸浴對(duì)小黃魚(yú)性腺發(fā)育及性腺成熟系數(shù)的影響

于60 d時(shí)，秤取不同濃度浸浴實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組C（95%）、C（0）性腺重量，區(qū)分對(duì)照組雌雄并分別計(jì)算GSI。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，實(shí)驗(yàn)組 E1、E10、E50 和 C（0）雌性相比GSI沒(méi)有顯著性差異，并且這四組顯著高于C（95%）雄性、C（95%）雌性和 C（0）雄性（圖 2）。

對(duì)E2不同濃度浸浴組（1、10和 50 μg/L）及對(duì)照組C（0）雌性、C（0）雄性、C（95%）雄性和 C（95%）雌性小黃魚(yú)于60 d時(shí)進(jìn)行解剖學(xué)觀察，由于性腺在腹腔內(nèi)難于辨認(rèn)，因此滴加波恩氏液再進(jìn)行拍照，結(jié)果表明，對(duì)照組C（0）性腺已經(jīng)產(chǎn)生較為明顯的雌雄差異，C（0）卵巢與C（0）精巢相比性腺發(fā)育較粗、飽滿、易識(shí)別；E1和E10與C（0）卵巢相似，但性腺長(zhǎng)度更短，性腺頭端更加粗短，隨著濃度的升高，更加傾向于圓柱形，E50性腺發(fā)育畸形，魚(yú)鰾末端與性腺末端相連，形成塊狀。C（95%）卵巢與精巢從外觀上無(wú)法準(zhǔn)確辨認(rèn)雌雄，且它們之間的GSI數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著性差異（圖3）。

圖2 不同浸浴濃度雌激素E2對(duì)小黃魚(yú)性腺成熟系數(shù)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of estrogen （E2）on Gonadosomatic index of L.polyactis

圖3 不同浸浴濃度雌激素E2及對(duì)照組小黃魚(yú)性腺解剖學(xué)觀察Fig.3 The morphology and anatomical observation of gonads in different concentrations of estrogen （E2）and control groups of L.polyactis

2.3 E2浸浴小黃魚(yú)性腺組織學(xué)觀察

組織學(xué)觀察不同浸浴濃度E2及對(duì)照組小黃魚(yú)性腺（圖4）。結(jié)果表明，60 d時(shí)對(duì)照組C（0）卵巢已出現(xiàn)二時(shí)相至三時(shí)相卵母細(xì)胞，并伴有卵巢腔，而C（0）精巢仍然未開(kāi)始減數(shù)分裂，性腺充滿精原細(xì)胞。C（95%）卵巢雖出現(xiàn)了二時(shí)相的卵母細(xì)胞，但整個(gè)卵巢發(fā)育不飽滿，體細(xì)胞較多，呈現(xiàn)出發(fā)育滯后的狀態(tài)；C（95%）精巢則形態(tài)松散，只見(jiàn)少量的精原細(xì)胞。E1、E10、E50組均出現(xiàn)二時(shí)相至三時(shí)相卵母細(xì)胞，E1、E10組有明顯卵巢腔，E50組性腺形狀非圓形。

圖4 不同浸浴濃度雌激素（E2）及對(duì)照組小黃魚(yú)性腺組織學(xué)觀察Fig.4 Histological observation of the gonads in different concentrations of estrogen （E2）of L.polyactis

通過(guò)組織切片觀察，統(tǒng)計(jì)不同雌激素E2浸浴組及對(duì)照組小黃魚(yú)性別比例情況，結(jié)果表明，E1的雌性率為82%，E10為88%，E50為63%，當(dāng)濃度達(dá)到E10以上時(shí)，未發(fā)現(xiàn)雄性及未分化性腺，且隨著濃度的上升，出現(xiàn)畸形的比率上升。C（95%）養(yǎng)殖的雌雄性別比例與C（0）的雌雄性別比例相近，都近似1:1（表1）。

表1 不同雌激素（E2）浸浴對(duì)小黃魚(yú)性別比例的影響Tab.1 Effects of different concentrations of estrogen （E2）on sex ratio of L.polyactis

3 討論

3.1 雌激素E2抑制小黃魚(yú)的生長(zhǎng)

本研究中各實(shí)驗(yàn)組濃度均抑制了小黃魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育，且隨著E2濃度的升高，抑制作用與對(duì)照組相比更顯著。這點(diǎn)主要表現(xiàn)為E2浸浴組在60 dat時(shí)體長(zhǎng)與體重均顯著性低于對(duì)照組。本研究結(jié)果與CARVALHO，et al[14]在小鋸蓋魚(yú)Centropomus undecimalis的投喂實(shí)驗(yàn)組，50和100 mg/kg均抑制體長(zhǎng)和體重的增長(zhǎng)；BULKLEY[15]報(bào)道的斑鮰Ictalurus punctatus攝食含有乙基雌酚的餌料時(shí)，當(dāng)濃度為2.2 mg/kg會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)減慢。及BLáZQUEZ，et al[16]在歐洲鱸Dicentrarchus labrax中也發(fā)現(xiàn)E2會(huì)抑制體重的增長(zhǎng)結(jié)果相一致。然而，MALISON，et al[17]發(fā)現(xiàn)投喂?jié)舛葹?5 μg/g的含有E2的飼料，可以促進(jìn)金鱒Perca fkvescens的體重增加；李國(guó)超[18]選用10 ng/L的E2溶液分別對(duì)10 hpf（受精后10 h）的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行處理，得出E2的毒性主要體現(xiàn)在會(huì)抑制細(xì)胞增殖和增強(qiáng)皮膚屏障作用，也推測(cè)出高濃度E2會(huì)影響了某些控制體軸發(fā)育的關(guān)鍵基因的正常表達(dá)。因此E2對(duì)小黃魚(yú)生長(zhǎng)上呈負(fù)面影響，這一點(diǎn)可能是由于E2的毒性所致。這些研究表明雌激素用于魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，有正負(fù)兩方面的結(jié)果。這取決于對(duì)激素種類(lèi)、劑量的選擇和實(shí)驗(yàn)魚(yú)對(duì)所用激素、劑量的適應(yīng)性[19]。

3.2 雌激素E2可誘導(dǎo)小黃魚(yú)雌性化

由于小黃魚(yú)人工自然水溫養(yǎng)殖環(huán)境下雌雄性比近似為1:1，在自然水溫的條件下的人工養(yǎng)殖對(duì)小黃魚(yú)性腺分化的影響較小，因此本研究水溫采用自然水溫，并沒(méi)有對(duì)養(yǎng)殖水溫進(jìn)行控制。根據(jù)表1的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，雌激素E2對(duì)小黃魚(yú)卵巢的分化具有促進(jìn)作用，浸浴低劑量的E2便可提高小黃魚(yú)的雌性比例，且E2對(duì)性腺的發(fā)育有一定的抑制作用，隨著濃度的升高，會(huì)出現(xiàn)性腺發(fā)育畸形的現(xiàn)象。本研究結(jié)果與MEIJIDE，et al[20]在玉麗體魚(yú)Cichlasoma dimerus中浸浴濃度為1 μg/L的E2誘導(dǎo)雌性率為88.5%，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了兼性性腺但未發(fā)現(xiàn)不育性腺一致，而B(niǎo)LáZQUEZ，et al[16]在歐洲鱸中雌激素投喂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在受精后60～260 d的期間E2誘導(dǎo)會(huì)出現(xiàn)兼性和不育性腺，乙炔基雌二醇（17α-ethynylestradiol，EE2）誘導(dǎo)會(huì)出現(xiàn)不育性腺，正常雌性誘導(dǎo)率分別為13%和80%，在48～88 dpf時(shí)期段EE2處理不會(huì)發(fā)生畸形性腺的現(xiàn)象，在226～426 dpf時(shí)期段E2處理會(huì)發(fā)生兼性性腺的現(xiàn)象。王星等[21]在E2濃度為259、1 180 ng/L的浸浴處理中，稀有鮈鯽Gobiocypris rarus雄性性腺則出現(xiàn)了明顯的萎縮現(xiàn)象，精巢組織中的大量生殖細(xì)胞被脂肪組織取代，精巢生殖細(xì)胞數(shù)量減少。本研究中E2處理從低濃度到高濃度都有部分畸形性腺發(fā)生，由于處理時(shí)期較早，未發(fā)現(xiàn)兼性性腺。PANDIAN，et al[22]總結(jié)出類(lèi)固醇激素處理會(huì)導(dǎo)致部分魚(yú)類(lèi)兼性性腺或性腺不育。雌激素的處理的時(shí)間和種類(lèi)對(duì)性腺發(fā)育和分化也會(huì)有相應(yīng)影響。

3.3 乙醇抑制小黃魚(yú)性腺的發(fā)育

本研究中，低劑量的乙醇浸浴對(duì)小黃魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育及性別分化影響較小，這主要體現(xiàn)在乙醇浸浴組與無(wú)添加乙醇對(duì)照組體長(zhǎng)體重均無(wú)顯著差異，及這兩組中性別比例都近似1:1。但乙醇浸浴對(duì)性腺的發(fā)育具有抑制的作用，這體現(xiàn)在95%乙醇浸浴組與不添加乙醇組的GSI水平前者顯著低于后者。在哺乳動(dòng)物研究中，CALLEJA，et al[23]認(rèn)為酒精通過(guò)不同的機(jī)制產(chǎn)生的毒性，會(huì)導(dǎo)致許多激素的變化，導(dǎo)致性腺器官的功能障礙和不育的問(wèn)題，在白鼠的酒精處理實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)白鼠的體重增加緩慢，睪丸體積減小且抑制精小管的發(fā)育，這與本研究結(jié)果一致。而OXENDINE，et al[24]在青鳉Oryzias latipes受精卵發(fā)育0～3、3～6和6～9 d三個(gè)時(shí)期分別暴露在0.1%、0.5%和1%的乙醇濃度下，結(jié)果現(xiàn)實(shí)三種乙醇浸浴濃度均抑制了青鳉魚(yú)頭寬的增長(zhǎng)。體長(zhǎng)的生長(zhǎng)在0～3和6～9 d這兩個(gè)時(shí)期受抑制最為明顯，這一點(diǎn)與本研究不同，可能是由于本研究所加的乙醇濃度非常低所致。因此，根據(jù)乙醇暴露劑量的不同，會(huì)對(duì)仔魚(yú)生長(zhǎng)和性腺發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度（1、10和50 μg/L）E2浸浴都將引起小黃魚(yú)群體的雌性化并抑制身體生長(zhǎng)，隨著濃度的升高，抑制作用越顯著。綜合比較雌性化率及產(chǎn)生畸形率得出當(dāng)E2濃度為10 μg/L時(shí)，誘導(dǎo)效果最好，主要表現(xiàn)在雌性率最高。