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        氯沙坦通過(guò)AT1R/VEGF信號(hào)通路對(duì)肝癌血管生成的影響

        2018-09-18 00:57:40武榮張俊濤李衛(wèi)斌王坤劉志貞
        關(guān)鍵詞:氯沙坦細(xì)胞系肝癌

        武榮,張俊濤,李衛(wèi)斌,王坤,劉志貞

        (1.臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室,山西 臨汾 041000;2.山西醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,山西 太原 030001;3.山西大醫(yī)院 普外科,山西 太原 030032;4.山西省太原市第三人民醫(yī)院 肝病二科,山西 太原 030012)

        全世界范圍內(nèi)肝癌的發(fā)病率排第6位,死亡率排第3位[1-2]。微血管密度(microvessel density, MVD)被認(rèn)為是肝癌和其他癌癥預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)[3]。AngⅡ 1型受體(angiotensin Ⅱ receptor 1, AT1R)阻抑劑氯沙坦具有抗高血壓的作用[4-5]。黑色素瘤[6]、胰腺癌[7]、腎癌[8]和膀胱癌[9]都表達(dá)AT1R。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AT1R拮抗劑可以抑制AT1R表達(dá)的腫瘤血管生成,但機(jī)制尚不清楚[10]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞和大鼠肝癌組織中AT1R的表達(dá),研究氯沙坦對(duì)血管生成的作用,從而證明AT1R為肝癌腫瘤血管生成的有效靶點(diǎn)。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑

        AngⅡ、氯沙坦、Hoechst、蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,胎牛血清、DMEM、MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,AT1R一抗、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)一抗、CD34一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,VEGF ELISA kit(美國(guó)Pepro Tech公司)。

        1.2 細(xì)胞

        肝癌細(xì)胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5,以及正常肝細(xì)胞LO2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        健康雄性SD大鼠24只,體重230~250 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證:C57B/L-B6D2F1/Crl,302),在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)菌培養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)。所做處理均符合鄭州大學(xué)動(dòng)物倫理中心制定的章程。

        1.4 方法

        1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2和HuH-7培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中,PLC/PRF/5和LO2培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%雙抗MEM培養(yǎng)液中。將其放置于在37℃、5%二氧化碳CO2,相對(duì)濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        1.4.2 大鼠肝癌模型的復(fù)制 將24只大鼠麻醉,腹腔注射10%水合氯醛,0.1 ml/只。大鼠取仰臥位,將其四肢固定于實(shí)驗(yàn)板上,用剪子小心剃去胸腹部毛后擦拭安爾碘消毒,沿腹白線逐層開(kāi)腹,暴露腹腔,輕壓胸腔后,肝臟暴露出腹腔,選取最接近體表的肝葉種植腫瘤。用注射針頭斜行進(jìn)針,刺入肝臟約1 cm,輕推注射器針芯,緩慢注入細(xì)胞懸液20μl,約1×106個(gè)HepG2細(xì)胞,緩慢退針,用無(wú)菌棉簽輕壓片刻后輕送肝臟進(jìn)入腹腔,逐層關(guān)腹。繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠,待成瘤模型復(fù)制成功后(皮下結(jié)節(jié)直徑<0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)),開(kāi)始給大鼠(其中12只)喂藥氯沙坦(5 mg/kg),持續(xù)給藥2周,處死大鼠,取肝癌組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.4.3 Western blot檢測(cè) 將肝癌細(xì)胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5,以及正常肝細(xì)胞LO2培養(yǎng)于75 mm2培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞長(zhǎng)大約90%時(shí),用細(xì)胞刮刀刮下,冰上裂解提取蛋白。將HepG2細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于6孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),分別添加0、1、10、100和1 000 nmol/L AngⅡ,100 nmol/L AngⅡ+0.1μmol/L氯沙坦,100 nmol/L AngⅡ+1.0μmol/L氯沙坦,1 000 nmol/L AngⅡ+10.0μmol/L氯沙坦,培養(yǎng)24 h。用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞,冰上裂解提取蛋白,用二喹啉甲酸法測(cè)定每組蛋白質(zhì)濃度,總蛋白上樣量為35μg/孔,上完樣后進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜(80 V,90 min),5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗膜5 min/次,共5次。分別用一抗 AT1R(1 ∶ 500)、GAPDH(1 ∶ 1 000)4℃過(guò)夜,TBST洗膜5 min/次,共5次。用稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔二抗37℃搖床反應(yīng)1 h,TBST洗膜5 min/次,共5次。采用ECL試劑盒進(jìn)行顯色,凝膠成像分析系統(tǒng)拍照后,用Lab Works 4.6軟件進(jìn)行灰度值分析。

        1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 將 HepG2細(xì)胞按 1×106個(gè) /孔接種于6孔板,細(xì)胞貼壁12 h后,用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)12 h,添加100 nmol/L AngⅡ、100 nmol/L AngⅡ+0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ+1.0μmol/L氯沙坦、1 000nmol/L AngⅡ+10.0μmol/L氯沙坦,培養(yǎng)24 h。吸取培養(yǎng)液于離心管中,3 500 r/min離心10 min,取上清液。VEGF的檢測(cè)按照VEGF ELISA kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

        1.4.5 免疫組織化學(xué)法 取大鼠肝癌組織制成切片,將切片固定于載玻片上干燥處理。將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中進(jìn)行脫蠟,然后逐級(jí)放置于100%純酒精Ⅰ、Ⅱ,95%、80%和70%酒精,以及水中各5 min,進(jìn)行水化。水化后的切片放于3%雙氧水 H2O2中室溫孵育10 min,PBS洗滌3次。將切片放入檸檬酸緩沖液(0.01 nmol/L,pH 6.0)中,加熱至沸騰改中火(>92℃),室溫下復(fù)溫,PBS洗滌3次。吸干多余液體,滴加山羊血清封閉液,37℃孵育30 min。分別滴加AT1R(1 ∶ 300)、VEGF(1 ∶ 800)和 CD34(1 ∶ 600)一抗4℃過(guò)夜,取出后在37℃烤箱中復(fù)溫30 min,PBST洗3次。滴加生物素抗兔二抗,37℃孵育1 min,PBST洗滌3次。用DAB試劑盒顯色10 min,顯色終止后清洗切片。滴加蘇木精室溫染液3 min,清水洗掉蘇木精染液,鹽酸酒精分化1 s,氨水返藍(lán)5 min。將切片分別放入70%和80%酒精各1 min,90%酒精2 min,95%酒精3 min,100%酒精Ⅰ、Ⅱ各3 min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min,取出晾干后用中性樹(shù)膠封片。每個(gè)標(biāo)本以只滴加PBS液作為陰性對(duì)照,在顯微鏡下觀察各切片著色情況。

        1.4.6 免疫熒光染色 將蓋玻片放到6孔板中,肝癌細(xì)胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5,以及正常肝細(xì)胞LO2均按1×105個(gè)/ml接種于6孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí),棄上清,PBS洗3次,10 min/次。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min,PBS洗3次,添加0.1%Triton X-100細(xì)胞打孔,1%胎牛血清白蛋白封閉,加入AT1R(1∶500)抗體4℃過(guò)夜,PBS洗3次,加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗和Hoechst,室溫孵育1 h,將蓋玻片放到載玻片上,熒光顯微鏡下觀察拍照。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗(yàn)或方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 AT1R在各細(xì)胞系中的表達(dá)

        熒光顯微鏡下觀察AT1R在肝癌細(xì)胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5,以及正常肝細(xì)胞LO2中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)AT1R在正常肝細(xì)胞LO2中綠色熒光強(qiáng)度低,而在肝癌細(xì)胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5中綠色熒光強(qiáng)度高,在HepG2細(xì)胞中綠色熒光最強(qiáng),即AT1R在HepG2細(xì)胞中表達(dá)最高。見(jiàn)圖1。

        圖1 AT1R在各細(xì)胞系中的表達(dá) (熒光顯微鏡×100)

        2.2 AT1R蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá)

        為進(jìn)一步證明熒光顯微鏡的觀察結(jié)果,采用Western blot檢測(cè)AT1R在肝癌細(xì)胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5,以及正常肝細(xì)胞LO2中的表達(dá),其相對(duì)表達(dá)量分別為(1.00±0.03)、(0.37±0.02)、(0.36±0.02)、(0.11±0.02),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=829.274,P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),AT1R在正常肝細(xì)胞LO2中低表達(dá),在肝癌細(xì)胞系HepG2中高表達(dá)(t=1.874,P=0.008),在HuH-7和PLC/PRF/5中高表達(dá)(t=1.272和 1.568,P=0.032 和 0.019)。見(jiàn)圖2。

        圖2 AT1R蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá) (±s)

        2.3 氯沙坦對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2中AT1R蛋白表達(dá)的影響

        上述實(shí)驗(yàn)表明AT1R在肝癌細(xì)胞系HepG2中表達(dá)最高,故進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)氯沙坦對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2中AT1R表達(dá)的影響。0、1、10、100和1 000 nmol/L AngⅡ濃度組的AT1R蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.10±0.01)、(0.14±0.02)、(0.25±0.03)、(0.36±0.03)、(0.51±0.03),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=131.774,P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),0 nmol/L與1 nmol/L AngⅡ比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.325,P=0.078);與0 nmol/L AngⅡ相比,從10 nmol/L AngⅡ開(kāi)始,隨著AngⅡ濃度增加,AT1R蛋白表達(dá)量逐漸升高(t=1.643、3.428和 2.953,P=0.014、0.000 和 0.000)。見(jiàn)圖3。

        圖3 不同濃度AngⅡ?qū)Ω伟┘?xì)胞系HepG2中AT1R蛋白的表達(dá)的影響 (±s)

        0 nmol/L AngⅡ+0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ+0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ+0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ+1.0μmol/L氯沙坦、1 000 nmol/L AngⅡ+10.0μmol/L氯沙坦組的AT1R 相對(duì)表達(dá)量分別為(0.21±0.02)、(0.84±0.03)、(0.52±0.02)、(0.31±0.03)、(0.29±0.03),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=281.878,P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),與100 nmol/L AngⅡ+0.0μmol/L氯沙坦組相比,隨著氯沙坦?jié)舛仍黾樱珹T1R蛋白表達(dá)水平逐漸降低(t=2.953、4.058和3.194,均P=0.000)。見(jiàn)圖4。

        2.4 氯沙坦對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2中VEGF的影響

        圖4 不同濃度AngⅡ+氯沙坦對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2中AT1R蛋白表達(dá)的影響 (±s)

        AngⅡ + 0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ +0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ+1.0μmol/L氯沙坦、1 000 nmol/L AngⅡ+10.0μmol/L氯沙坦組的VEGF表達(dá)量分別為(730.1±10.0)、(806.6±18.1)、(789.0±12.0)、(780.8±1.0)、(769.7±1.0),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.322,P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),100 nmol/L AngⅡ+0.0μmol/L氯沙坦組較0 nmol/L AngⅡ+0.0μmol/L氯沙坦組的VEGF表達(dá)量增加(t=1.215,P=0.041);與100 nmol/L AngⅡ+0.0μmol/L氯沙坦組比較,當(dāng)氯沙坦的濃度為1.0μmol/L時(shí),VEGF的表達(dá)量降低(t=1.383,P=0.030);當(dāng)氯沙坦的濃度為10.0μmol/L時(shí),VEGF的表達(dá)量進(jìn)一步降低(t=1.407,P=0.028)。見(jiàn)圖5。

        2.5 氯沙坦對(duì)大鼠肝癌組織中AT1R、VEGF及CD34表達(dá)的影響

        免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示,氯沙坦對(duì)AT1R、VEGF及CD34的表達(dá)有較明顯的影響(見(jiàn)圖6)。對(duì)照組和氯沙坦組的AT1R陽(yáng)性表達(dá)率分別為(62.07±3.86)%和(43.57±4.21)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.920,P=0.034),氯沙坦組較低(見(jiàn)圖7)。對(duì)照組和氯沙坦組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為(57.38±6.16)%和(19.87±3.29)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.963,P=0.000),氯沙坦組較低(見(jiàn)圖8)。對(duì)照組和氯沙坦組的AT1R陽(yáng)性表達(dá)率分別為(56.83±5.17)%和(17.56±3.12)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.536,P=0.000),氯沙坦組較低(見(jiàn)圖9)。

        圖5 氯沙坦對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2中VEGF的影響 (±s)

        圖6 大鼠肝癌組織中AT1R、VEGF及CD34的陽(yáng)性表達(dá) (免疫組織化學(xué)法×800)

        圖7 氯沙坦對(duì)大鼠肝癌組織中AT1R表達(dá)的影響 (±s)

        圖8 氯沙坦對(duì)大鼠肝癌組織中VEGF表達(dá)的影響 (±s)

        圖9 氯沙坦對(duì)大鼠肝癌組織中CD34表達(dá)的影響 (±s)

        3 討論

        AT1R在乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌等各種惡性腫瘤中表達(dá)[11]。有報(bào)道表明,AT1R參與多種動(dòng)物模型中腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。但是在人肝癌細(xì)胞中,AT1R的表達(dá)報(bào)道甚少。FAN等[13]證明,AT1R在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá),其與肝癌的血管生成相關(guān)。本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明AT1R阻斷劑氯沙坦對(duì)肝癌血管生成的影響。免疫組織化學(xué)法結(jié)果表明,肝癌細(xì)胞中均有AT1R的表達(dá),同時(shí)VEGF在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)與AT1R一致。VEGF是由腫瘤細(xì)胞分泌的、重要的血管生成刺激因子,同時(shí)VEGF的表達(dá)與肝癌預(yù)后有關(guān)。通過(guò)上調(diào)VEGF可以刺激血管的生成,AngⅡ通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體AT1R結(jié)合,介導(dǎo)很多細(xì)胞效應(yīng)。因此,AngⅡ-AT1R-VEGF系統(tǒng)在控制肝癌細(xì)胞血管生成中有重要作用。

        除了VEGF,腫瘤內(nèi)的MVD也是評(píng)估惡性腫瘤患者預(yù)后的重要定量參數(shù)。CD31、CD34、vWF為鑒定MVD的上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志[14]。MVD與AT1R的表達(dá)呈正相關(guān),約70%高M(jìn)VD樣本中,AT1R有高表達(dá)現(xiàn)象。MVD可以有效反映腫瘤血管的生成。并且MVD的增加與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)[15]。筆者推測(cè),AT1R對(duì)肝癌血管的生成具有重要作用,所以AT1R對(duì)調(diào)節(jié)VEGF-A具有重要作用。血管生成已成為藥物治療的一個(gè)重要的靶點(diǎn),許多血管生成抑制藥物已經(jīng)用于臨床。在本研究中,AngⅡ通過(guò)上調(diào)AT1R蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞中VEGF的產(chǎn)生,同時(shí)氯沙坦可以抑制該現(xiàn)象。本研究同時(shí)證明,氯沙坦可以有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和VEGF的表達(dá)。作為AT1R的抑制劑,氯沙坦可以抑制體內(nèi)固體瘤的生長(zhǎng),這種抑制可能是通過(guò)抑制血管生成介導(dǎo)的。

        AT1R參與癌細(xì)胞增殖。但是SUGANUMA等[16]實(shí)驗(yàn)表明,AngⅡ不能有效地促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中,AngⅡ可以增加VEGF的分泌,AT1R也許沒(méi)有直接參與肝癌細(xì)胞的增殖,并且血管緊張素Ⅱ-AT1R體系在不同類型腫瘤細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中也起到不同的作用。

        綜上所述,本研究結(jié)果表明,AT1R表達(dá)于肝癌細(xì)胞中,并與腫瘤血管生成有關(guān)。AT1R的抑制劑可以抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中腫瘤血管的生成。盡管如此,AT1R阻抑劑氯沙坦的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,氯沙坦既無(wú)直接的毒性作用,也無(wú)抗增殖的作用。根據(jù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果,筆者將氯沙坦的抗腫瘤作用歸結(jié)于抗血管的生成作用,而不是直接的毒性作用。AT1R不僅是一個(gè)很有潛力的預(yù)后指示因子,而且是肝癌治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

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