楊安，沈艷峰

1邯鄲市中心醫(yī)院普外科，河北 邯鄲056001

2河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 邯鄲0560020

雖然近年來胃癌總體的發(fā)病率和病死率逐漸下降，但轉(zhuǎn)移性胃癌（metastatic gastric cancer，MGC）的發(fā)病率卻明顯上升，約占新發(fā)胃癌病例的40%[1]。MGC處于腫瘤晚期，患者的全身性并發(fā)癥較多，5年生存率不到5%，即使行全身系統(tǒng)性化療，其中位生存時(shí)間也僅12個(gè)月左右，預(yù)后極差[2-3]。惡性腫瘤具有侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，是引起腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。作為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因編碼的蛋白質(zhì)，KISS1蛋白抑制腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用正逐漸受到重視。研究表明，KISS1蛋白在人體多種惡性腫瘤中發(fā)揮腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用[4-5]。KISS1基因是由Lee和Welch[6]首次在人類黑色素腫瘤細(xì)胞中分離出的一種含4個(gè)外顯子的cDNA片段，定位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂lq32-q41區(qū)，其羧基末端（61～121）含有54個(gè)氨基酸的殘基肽是人孤兒G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)源性配體，稱為轉(zhuǎn)移抑素（metastin），其與G蛋白偶聯(lián)受體54（G-protein coupled receptor 54，GPR54）結(jié)合可使細(xì)胞內(nèi)磷脂酶-c介導(dǎo)的ERK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞趨化、增殖及轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7-8]。關(guān)于KISS1蛋白與MGC侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織中KISS1蛋白的表達(dá)水平，分析KISS1蛋白與MGC患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月至2015年6月邯鄲市中心醫(yī)院收治的63例MGC患者手術(shù)切除的胃癌組織及其中50例癌旁組織（距陰性切緣＞5 cm，經(jīng)病理證實(shí)為正常胃黏膜組織）標(biāo)本，另收集同期60例非轉(zhuǎn)移性胃癌（non-metastatic gastric cancer，NMGC）患者手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本。MGC患者中，腹膜、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移34例，肝轉(zhuǎn)移11例，鎖骨上及腹膜后等遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均因梗阻、出血或穿孔等原因行姑息性胃切除術(shù)；②術(shù)后病理學(xué)檢查確診為胃癌，轉(zhuǎn)移灶經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)源于胃癌；③術(shù)前均未接受腫瘤相關(guān)治療；④具有完整的臨床資料及隨訪資料。

1.2 試劑

兔抗人KISS1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將采集的組織標(biāo)本切成1 cm3小塊，以10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，按4 μm厚連續(xù)切片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin perosidase，SP）法進(jìn)行染色，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知KISS1陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

KISS1免疫組化產(chǎn)物為定位于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色細(xì)顆粒。采用半定量分析方法[9]，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，陽性細(xì)胞百分比﹤10%計(jì)1分，陽性細(xì)胞百分比為10%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞百分比﹥50%計(jì)3分；根據(jù)染色程度計(jì)分，無色為0分，淡黃色為1分，中度黃色為2分，棕褐色為3分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比計(jì)分的乘積≥3分為陽性，﹤3分為陰性。免疫組化結(jié)果由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師通過雙盲法獨(dú)立判定。

1.5 隨訪

采用門診、電話等方式進(jìn)行隨訪，隨訪截至2017年10月，隨訪時(shí)間為4～48個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為20個(gè)月。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移主要經(jīng)CT、MR及PET-CT等檢查明確，無瘤生存期定義為術(shù)后至復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或隨訪截止時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP法檢測(cè)各組KISS 1蛋白的表達(dá)情況

KISS1蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。MGC、NMGC及癌旁組織中KISS1蛋白的陽性表達(dá)率分別為23.8%（15/63）、43.3%（26/60）和82.0%（41/50），3者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=38.468，P﹤0.05）。其中，MGC組織和NMGC組織中KISS1蛋白的陽性表達(dá)率均低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；MGC組織和NMGC組織中KISS1蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。

2.2 MGC組織中KISS 1蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

MGC組織中KISS1蛋白的陽性表達(dá)率與胃癌大體類型、有無脈管癌栓及浸潤(rùn)深度有關(guān)（P﹤0.05）；而不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平的MGC患者胃癌組織中KISS1蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 MGC組織中KISS 1蛋白表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系（ n=63）

2.3 MGC組織中KISS 1蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

63例MGC患者均獲得術(shù)后隨訪。MGC患者的生存時(shí)間為4～27個(gè)月，中位總生存時(shí)間為8個(gè)月，1年生存率為25.4%（16/63），詳見圖1。Kaplan-Meier生存分析顯示，KISS1蛋白陽性表達(dá)MGC患者的中位生存時(shí)間為13個(gè)月，1年生存率為53.3%（8/15）；而KISS1蛋白陰性表達(dá)MGC患者的中位生存時(shí)間為8個(gè)月，1年生存率為16.7%（8/48）；兩者的總體生存情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.290，P=0.012），詳見圖2。將MGC患者的臨床特征及KISS1蛋白表達(dá)情況納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，KISS1蛋白陽性表達(dá)是影響MGC患者預(yù)后的保護(hù)因素（HR：0.442，95%CI：0.239～0.818，P=0.009）。

圖1 63例MGC患者的生存曲線

圖2 KISS 1蛋白陽性表達(dá)（ n=15）與陰性表達(dá)（ n=48）MGC患者的生存曲線

2.4 NMGC組織中KISS 1蛋白表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

60例NMGC患者中，50例患者獲得術(shù)后隨訪，其中KISS1蛋白陽性表達(dá)23例，陰性表達(dá)27例。KISS1蛋白陽性表達(dá)NMGC患者的中位無瘤生存時(shí)間為27個(gè)月，1、2、3年無瘤生存率分別為95.7%、60.3%及43.5%；KISS1蛋白陰性表達(dá)NMGC患者的中位無瘤生存時(shí)間為16個(gè)月，1、2、3年無瘤生存率分別為70.4%、20.8%及15.6%。KISS1蛋白陽性表達(dá)和陰性表達(dá)NMGC患者的1、2、3年無瘤生存率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.345，P=0.037；χ2=18.123，P﹤0.01；χ2=14.772，P﹤0.01）。KISS1蛋白陽性表達(dá)和陰性表達(dá)NMGC患者的總體無瘤生存情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.176，P﹤0.01）。（圖3）

圖3 KISS 1蛋白陽性表達(dá)（ n=23）與陰性表達(dá)（ n=27）NMGC患者的無瘤生存曲線

3 討論

侵襲與轉(zhuǎn)移是胃癌的重要生物學(xué)特征，MGC患者因其腫瘤細(xì)胞的高度轉(zhuǎn)移特性，預(yù)后極差。胃癌的轉(zhuǎn)移是多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，研究相關(guān)基因在胃癌轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制，抑制胃癌的惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移，對(duì)提高患者的生存率具有重要意義[10]。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KISS1在阻斷惡性腫瘤局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用正受到眾多學(xué)者的青睞。Lee和Welch[6]的研究首先證實(shí)KISS1為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。之后Kostadima等[11]的研究顯示，KISS1基因編碼的KISS1蛋白可以影響腫瘤細(xì)胞的分化和增殖，促使其凋亡。而KISS1蛋白抑制腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制包括調(diào)控腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞遷移，改變腫瘤細(xì)胞的黏附性、化學(xué)趨向性和減少腫瘤集落形成等[10,12-15]。

KISS1蛋白在胃癌中的陽性表達(dá)率低或呈缺失性表達(dá)，對(duì)胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移起重要作用，并影響預(yù)后。周蕾等[16]研究發(fā)現(xiàn)，KISS1蛋白在胃腺癌中的陽性表達(dá)率為45.2%，而在正常胃黏膜中的陽性表達(dá)率卻高達(dá)87.5%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著KISS1蛋白表達(dá)率的降低，胃癌的浸潤(rùn)越深，腫瘤分期越高，淋巴結(jié)越易于轉(zhuǎn)移；其研究結(jié)果表明KISS1蛋白表達(dá)的缺失或低表達(dá)導(dǎo)致其抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的能力降低，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)，最終導(dǎo)致胃癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Guan-Zhen等[17]研究報(bào)道，KISS1蛋白在肝轉(zhuǎn)移和（或）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的陽性表達(dá)率低于原發(fā)胃癌組織，提示KISS1蛋白在胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的抑制作用。另有學(xué)者認(rèn)為，KISS1蛋白的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈負(fù)相關(guān)[18]。表明KISS1蛋白的表達(dá)缺失或低表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可能是導(dǎo)致胃癌轉(zhuǎn)移的重要因素。Dhar等[19]通過核酸酶保護(hù)分析法測(cè)定胃癌組織中KISS1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)組較高表達(dá)組患者具有更高的脈管侵犯率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，且總生存率和無瘤生存率較低（P﹤0.01）?；莘品频萚20]的研究結(jié)果顯示，同時(shí)性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（colorectalcancerwith synchronouslivermetastases，sCRLM）患者中，KISS1蛋白陽性表達(dá)的患者術(shù)后生存率優(yōu)于陰性表達(dá)者。

本研究探討了KISS1蛋白在MGC、NMGC及癌旁組織中的表達(dá)情況，以研究KISS1蛋白在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用及對(duì)MGC患者預(yù)后的影響，其研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致：KISS1蛋白在癌旁組織、NMGC組織和MGC組織中的表達(dá)逐漸減少，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），值得探討的是，雖然MGC組織中KISS1蛋白的陽性表達(dá)率較NMGC組織低，但組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），提示胃癌在發(fā)生轉(zhuǎn)移前病變階段KISS1蛋白已經(jīng)出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能是由于樣本量不足所致，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果還顯示，腫瘤浸潤(rùn)程度深、存在脈管癌栓及浸潤(rùn)型癌等高危因素的MGC患者胃癌組織中的KISS1蛋白陽性表達(dá)率低，生存分析顯示，KISS1蛋白陽性表達(dá)患者的生存時(shí)間長(zhǎng)于陰性表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），說明KISS1蛋白的低表達(dá)或缺失在一定程度上影響MGC患者腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，且可作為MGC患者預(yù)后不良的指標(biāo)[12,21-22]。本研究結(jié)果顯示，NMGC患者中KISS1蛋白陰性表達(dá)者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，無瘤生存期短，進(jìn)一步印證了KISS1是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，在胃癌的發(fā)展、侵襲及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，其表達(dá)缺失或下調(diào)可以成為判斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移特性的重要生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)臨床制定個(gè)體化治療方案、判斷術(shù)后無瘤生存期及預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，KISS1蛋白在MGC患者的胃癌組織中陽性表達(dá)率低，腫瘤進(jìn)展快，預(yù)后差。KISS1蛋白在胃癌的發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，可以作為判斷腫瘤惡性程度的重要生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)，KISS1蛋白有望成為預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志物，后續(xù)可研究KISS1蛋白是否可作為靶點(diǎn)對(duì)MGC患者進(jìn)行基因治療。