丁曉爽，李 惠*

（淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255086）

外障眼病是臨床中常見的眼科疾病，易復發(fā)，其中結膜炎、角膜炎和沙眼為前3位外障眼病，現(xiàn)代醫(yī)學使用抗生素或激素類藥物的臨床效果并不理想，而中醫(yī)治療在古人經(jīng)驗的基礎上治療外障眼病具有一定優(yōu)勢。

清熱明目丸由金銀花、大青葉、麩炒枳殼、夏枯草、黃芩、菊花等14味藥制成，祛風清熱，退翳明目，可用于異物感、羞明流淚、目赤生翳等外障眼病。為控制制劑質量，確保其臨床應用安全有效，本文采用高效液相色譜法（HPLC）梯度洗脫方式對金銀花、菊花、麩炒枳殼、黃芩中的主要有效成分綠原酸、柚皮苷、黃芩苷進行定量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；CP225D電子分析天平（北京賽多利斯）；KS-300EI超聲波清洗機（寧波海曙科生）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號110753-201415，含量96.2 %）、柚皮苷對照品（批號110722-201613，含量94.3 %）、黃芩苷對照品（批號110715-201318，含量93.3 %）（中國食品藥品檢定研究院），清熱明目丸（淄博市中醫(yī)醫(yī)院，批號170407、170412、170418，規(guī)格：每瓶裝60 g），乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，0.4 %磷酸溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫；檢測波長：283 nm；柱溫40 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣體積：10 μl。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加50 %甲醇制成每1 ml含綠原酸0.1937 mg綠原酸對照品溶液；取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加50 %甲醇制成每1 ml含柚皮苷0.2056 mg柚皮苷對照品溶液；取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 ml含黃芩苷0.3682 mg的黃芩苷對照品溶液。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密量取綠原酸對照品溶液2 ml，柚皮苷對照品溶液1 ml，黃芩苷對照品溶液1 ml，置同一10 ml量瓶，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50 %甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，置入25 ml棕色量瓶，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取處方中去除金銀花、菊花、黃芩、麩炒枳殼外的其他藥材，按清熱明目丸處方比例和工藝制備陰性對照藥丸，按2.2.3項下方法，制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性及耐用性試驗

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。供試品溶液的色譜圖中，在與對照品溶液的色譜圖相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，且陰性無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 耐用性試驗 取2.2.3項下同一供試品溶液，按2.1項下色譜條件，用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、島津Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱試驗，各主峰的理論板數(shù)均不低于2000，各主峰之間及各主峰與相鄰雜質峰之間分離度均良好。

2.4 線性關系考察

分別精密量取2.2.1項下綠原酸對照品溶液0.2，0.4，1.0，2.0，4.0 ml；柚皮苷對照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 ml；黃芩苷對照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0、2.0 ml，對應加入20，20，10，10，10 ml量瓶，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述不同濃度的混合對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得綠原酸回歸方程Y=2×107X-9613，r=0.9998；柚皮苷回歸方程Y=2×107X+1576，r=0.9999；黃芩苷回歸方程Y=3×107X+336，r=0.9999。表明綠原酸、柚皮苷、黃芩苷分別在濃度為1.937～77.48，1.028～41.12，1.841～73.64 μg/ml范圍內與峰面積線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取2.2.2項下的混合對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，測得綠原酸、柚皮苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.12 %，0.45 %，0.16 %（n=6）。表明儀器精密度較好。

2.6 重復性試驗

取同批號（170418）的樣品6份，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μl注入液相色譜儀進行測定，測得綠原酸、柚皮苷、黃芩苷的平均含量分別為4.8522，2.1754，4.7973 mg/g，RSD分別為1.01 %，1.65 %，0.76 %（n=6），結果表明，本法具有較好的重復性。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取2.2.3項下制備的供試品溶液，分別于配制后在室溫下放置0，4，8，12，18，24 h各精密吸取10 μl注入液相色譜儀進行測定，測得綠原酸、柚皮苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.79 %，0.70 %，1.36 %。結果說明，供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗

取已知含量樣品（批號170418）9份，各約1.0 g，精密稱定，分別按樣品含量的50 %，100 %，150 %加入綠原酸、柚皮苷和黃芩苷對照品，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μl注入液相色譜儀進行測定，測得綠原酸、柚皮苷、黃芩苷的平均加樣回收率分別為98.6 %，98.6 %，99.1 %，RSD分別為1.6 %，1.2 %，1.2 %（n=9），詳見表2～表4。

表2 綠原酸加樣回收率試驗

表3 柚皮苷加樣回收率試驗

表4 黃芩苷加樣回收率試驗

2.9 樣品測定

取清熱明目丸3批（批號170407，170412，170418），按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定樣品中綠原酸、柚皮苷、黃芩苷的含量，結果見表5。

表5 樣品測定結果

3 討論

對于用藥分類而言，外障眼病的治療方法多以補氣血，通腑泄熱，清熱瀉火為常法，清熱明目丸處方中金銀花可清熱解毒；菊花可祛風清熱[1]，兩者均含有綠原酸，具有抗炎、抑菌、抗病毒等作用[2]，麩炒枳殼可疏通氣機，其主要成分柚皮苷有顯著鎮(zhèn)痛抗炎效果[3]，黃芩是外障眼病方劑中使用頻次較高的藥物，清肝明目、疏風清熱[4]，其主要有效成分黃芩苷具有抗菌、抗炎、抗過敏等作用[5]，它們對制劑療效至關重要，因此對其含量進行檢測，以保證制劑質量。

由文獻[6]可知，綠原酸、柚皮苷、黃芩苷分別在327，283，280 nm處有最大吸收，為使3種成分同時有較好的檢出靈敏度，分別在3個波長下將混合對照品溶液注入液相色譜儀測定，發(fā)現(xiàn)在327和280 nm下，柚皮苷峰的靈敏度較低，通過考慮樣品中3組份的含量，并且參照文獻[7-8]，最終選擇283 nm作為本次實驗的檢測波長。

在流動相的選擇上，通過查閱文獻[9-11]，考慮同時測定綠原酸、柚皮苷和黃芩苷的含量，分別對不同流動相、不同比例、不同洗脫方式等多方面進行篩選，最終確定了在該條件下測定3者含量，其分離效果好，基線平穩(wěn)，達到了預定含量測定的目的。

本方法能同時測定綠原酸、柚皮苷、黃芩苷，兼具準確度高、檢測線性范圍廣、方法重復性良好，并且能省時、省力、節(jié)約成本，可用于清熱明目丸的質量控制。