郭 羽，王 曉

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

腸道菌群約占人體總微生物量的78%，他們參與了人體的營養(yǎng)、免疫、代謝調(diào)節(jié)等諸多生理活動，被稱為“人體的第二基因庫”。近年來隨著廣譜和強力抗生素的廣泛使用，雖然感染性疾病在某種程度上得到了控制，但抗生素在殺死病原菌的同時也殺死了有益菌群，嚴(yán)重破壞了人體腸道的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)，進而引起糖尿病、肥胖、心腦血管疾病、結(jié)直腸癌等許多相關(guān)疾病［1］。因此，腸道菌群與人體健康息息相關(guān)，而如何維持腸道菌群的良好狀態(tài)成為醫(yī)學(xué)界許多學(xué)者關(guān)注的課題。

益生菌在腸道內(nèi)大量繁殖可調(diào)節(jié)紊亂的腸道菌群結(jié)構(gòu)并提高機體免疫力，進而幫助恢復(fù)健康水平。所以，有意增加人體腸道內(nèi)益生菌數(shù)量就顯得非常重要［1］。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）是人體腸道中重要的有益菌，腸道黏著率高，定植能力強，具有平衡腸道菌群、排除毒素、抑制有害菌生長、提高機體免疫力等生理保健功能［2］。正因為LGG有如此重要之健康促進功能，很多益生菌制劑都以其作為重要活菌成分。但鼠李糖乳桿菌真正在人體發(fā)揮功效，需保證一定數(shù)量的菌體經(jīng)過人體消化道，安全到達腸道。盡管鼠李糖乳桿菌相對于其他益生菌更能耐受消化道的酸性環(huán)境，但在經(jīng)過低pH的胃酸以及受到小腸高濃度膽鹽毒害時依然會遭到嚴(yán)重破壞或其活性受到抑制，從而大大降低了到達腸道中的活菌數(shù)量。因此尋找促進鼠李糖乳桿菌增殖的物質(zhì)，用以提高其在人體內(nèi)的水平或促進體外培養(yǎng)液中的增殖，提高其對胃腸道不良環(huán)境的耐受性成為關(guān)鍵問題。

越來越多研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖類成分尤其是補益類中藥對益生菌生長具有一定促進作用［3］。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經(jīng)提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖，是黃芪最重要的活性成分之一，具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等功效［4］，但能否促進鼠李糖乳桿菌的增殖并提高其抗逆性尚未見報道。本文探討了黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌增殖及其對酸、膽鹽等胃腸道不良環(huán)境的耐受性的影響，為黃芪現(xiàn)代化研究及鼠李糖乳桿菌功能性食品的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，NBRC3425）（上海瑞楚生物科技有限公司）。1.1.2 試劑 MRS培養(yǎng)基（上海瑞楚生物科技有限公司）；黃芪多糖（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）：膽鹽（北京索萊寶生物科技）；胃蛋白酶（1∶10 000）、胰蛋白酶（1∶250）美國 Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺（上海巴艾貝斯公司）；恒溫培養(yǎng)箱（蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司）；超低溫冰箱（中科美菱超低溫科技股份有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；酸度計（上海雷磁）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將-80℃凍存的鼠李糖乳桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)傳代3次備用。

1.2.2 黃芪多糖復(fù)配培養(yǎng)基的配制 在MRS液體培養(yǎng)基中加入黃芪多糖，微熱溶解，配制成黃芪多糖濃度分別為 0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%的APS/MRS復(fù)配增殖培養(yǎng)基，調(diào)整pH為7.0，121℃滅菌20 min備用。

1.2.3 不同濃度APS對LGG的增殖作用 將活化3代的菌種按1%（V/V）接種量（約1×106CFU/mL）接種于含有不同濃度黃芪多糖的MRS培養(yǎng)基中，平行3組，同時以不加黃芪多糖的MRS液體培養(yǎng)基為對照組，37℃培養(yǎng)16 h后，測定培養(yǎng)基中的活菌數(shù)。

活菌計數(shù)采用稀釋平板計數(shù)法：分別取1 μL上述各組發(fā)酵液，對樣品進行10倍系列梯度稀釋至合適濃度，加入MRS瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后計數(shù)，測定鼠李糖乳桿菌活菌含量，換算成菌落形成單位（CFU/mL）。

1.2.4 黃芪多糖對LGG產(chǎn)酸性能的影響 在復(fù)配質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%黃芪多糖的條件下對活化后的LGG進行培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中每隔2 h測定1次pH值，空白對照組不添加APS。

1.2.5 耐酸性實驗 將于復(fù)配培養(yǎng)基中發(fā)酵至對數(shù)生長期的鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液4 000 r/min離心25 min，棄去上清，沉淀菌體用滅菌MRS液體培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液濃度為5.0×108CFU/mL，按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種于1 mL pH分別為1.5、2.0、2.5、3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)2 h、4 h后取出，稀釋平板計數(shù)法檢測活菌數(shù)（n=3），換算成菌落形成單位（CFU/mL）并計算其存活率。存活率（%）=lgCFUN1/lgCFUN0×100%，N1=酸處理后的活菌數(shù)，N0=未處理前活菌數(shù)。

1.2.6 耐膽鹽實驗 在滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，無菌條件下添加0.3%的膽鹽，將APS/MRS復(fù)配培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌接種于含膽鹽液體MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)3 h，檢測活菌數(shù)。

1.2.7 人工模擬胃腸液穩(wěn)定性實驗 人工模擬胃腸液需新鮮配制［5］：在pH2.0的滅菌PBS中濾過除菌加入10 g/L的胃蛋白酶，制成人工胃液；在pH6.8的PBS中按0.3%加入膽鹽，滅菌，濾過除菌加入10 g/L胰蛋白酶，制成人工腸液。

將APS/MRS復(fù)配培養(yǎng)到對數(shù)期的鼠李糖乳桿菌按7%（約1×109CFU/mL）接種到人工胃液，同時添加2.5%黃芪多糖，充分混勻，在37℃孵育1 h、2 h、3 h 后，取樣，檢測活菌數(shù)，并計算存活率。將1 mL消化3 h的含菌人工胃液離心沉淀，收集菌體，用1 mL生理鹽水重懸，加入9 mL模擬腸液中，充分混勻，繼續(xù)于37℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、1、2和 4 h取樣，檢測活菌數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌增殖的影響

相對于空白對照組，在添加黃芪多糖的發(fā)酵液中，活菌數(shù)均顯著高于對照組（P＜0.05），說明黃芪多糖可以被鼠李糖乳桿菌利用。隨著APS濃度的增加，鼠李糖乳桿菌的生長表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢，在APS添加量為2.5%時活菌數(shù)達到最大，生物量約為1×109CFU/mL。當(dāng)APS高于3%時，促增殖效果反而減弱。結(jié)果見表1。

不同種類的中藥多糖及同一種中藥多糖的不同濃度對益生菌的增殖效果均存在一定差異［6］。黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌的增殖作用并非濃度越高越好，高濃度APS反而會產(chǎn)生抑制作用?？赡苡捎邳S芪多糖作為一種功能性多糖，在合適的添加范圍內(nèi)對于LGG的代謝調(diào)節(jié)有著積極的促進作用；而多糖濃度的增加使發(fā)酵液滲透壓增大，從而抑制了LGG的生長。

因此，一定濃度黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌增殖具有促進作用。決定以加入濃度為2.5%的黃芪多糖來對鼠李糖乳桿菌進行增殖培養(yǎng)。

2.2 黃芪多糖對LGG發(fā)酵液pH的影響

在培養(yǎng)過程中復(fù)配黃芪多糖培養(yǎng)基處理的實驗組和未添加黃芪多糖的對照組pH值均隨著培養(yǎng)時間的延長而降低。因鼠李糖乳桿菌本身是一種乳酸菌，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生少量醋酸和大量乳酸，因此發(fā)酵液呈酸性，發(fā)酵液pH值呈下降趨勢。此外，每個時間點實驗組發(fā)酵液pH值均低于對照組，表明黃芪多糖能被鼠李糖乳桿菌利用，并促進其增殖，產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，降低pH值。結(jié)果見圖1。

2.3 黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌耐酸性影響

圖1 黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液pH的影響

環(huán)境中的pH值通過影響細菌細胞膜電荷變化、改變其通透性或影響細菌酶活性而降低其代謝速率，不同微生物對酸的耐受能力不同。益生菌必須進入人體腸道才能發(fā)揮其益生功能，而從口腔經(jīng)消化道進入腸道，中間必須經(jīng)過胃。人體胃液呈酸性，空腹或者食用酸性食品后，pH值可低至1.5 左右［7］，因此，耐酸性是保證菌株穿過胃液安全進入腸道的一個必要條件。

在 pH 1.5 和 2.0 條件下維持2 h，以 2.5%黃芪多糖復(fù)配培養(yǎng)基培養(yǎng)的實驗組鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)分別能夠達到 0.83×107CFU/mL 和 0.99×107CFU/mL，存活率分別是 55.32%和 66.17%；隨著培養(yǎng)時間的延長，在4 h時活菌數(shù)都有不同程度的減少。而在pH值為2.5和3.0的培養(yǎng)基中生長較好，在 pH 3.0條件下存活率達到 94.71%，活菌數(shù)能夠接近1.42×107CFU/mL。因此，鼠李糖乳桿菌對酸的耐受性隨著pH升高而增加。與未添加黃芪多糖的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的對照組菌株相比，在相同的酸性條件下，其存活率和活菌數(shù)均高于對照組，表明LGG經(jīng)黃芪多糖處理后能增強對酸的耐受性。可能是黃芪多糖促使菌株通過酶促反應(yīng)釋放堿性物質(zhì)以中和酸性環(huán)境，并降低其對菌株造成的損傷和代謝的抑制。結(jié)果見表2。

2.4 黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌膽鹽耐受的影響

膽鹽（Bile salt）是由肝細胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合而形成的鈉鹽或鉀鹽，可在細胞外產(chǎn)生高滲透壓，對菌體細胞造成影響。人體小腸內(nèi)膽鹽濃度在 0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動［8］，因此本研究采用0.3%的膽鹽環(huán)境，觀察經(jīng)黃芪多糖處理的鼠李糖乳桿菌的膽鹽耐受能力，對照組菌株存活率為73.77%，APS/MRS復(fù)配培養(yǎng)的LGG菌株存活率為87.45%，較對照組提高了約1.2倍。表明APS能提高LGG的耐膽鹽能力。結(jié)果見表3。

表1 不同濃度黃芪多糖對LGG活菌數(shù)的影響 （lgCFU/mL，n=3，±s）

表1 不同濃度黃芪多糖對LGG活菌數(shù)的影響 （lgCFU/mL，n=3，±s）

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表2 黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌耐酸性影響

表3 黃芪多糖對膽鹽脅迫下鼠李糖乳桿菌存活率的影響

當(dāng)環(huán)境中的膽鹽濃度高于微生物細胞質(zhì)基質(zhì)的濃度時，會使微生物胞內(nèi)基質(zhì)外滲，繼而引起微生物死亡。實驗中添加黃芪多糖后，在膽鹽脅迫條件下，菌體的存活率高于空白對照。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是，黃芪多糖誘導(dǎo)鼠李糖乳桿菌體內(nèi)生成相應(yīng)的物質(zhì)，增加基質(zhì)濃度，使菌體內(nèi)與外部環(huán)境不會存在較高濃度差；還有可能是黃芪多糖會被特異性地吸附在菌體表面，使LGG對不利于自身生長的環(huán)境產(chǎn)生相應(yīng)的“應(yīng)急機制”，繼而能夠避免基質(zhì)外滲，增加存活率。

2.5 人工胃液耐受性實驗

益生菌作為一種生物制劑，在口服后進入消化道，除了胃酸和膽汁酸鹽外，還要遭受胃液中蛋白酶以及腸液中的胰蛋白酶等物質(zhì)的傷害，這些因素都會明顯影響其活菌數(shù)，進而影響其益生功效。為進一步考察復(fù)配黃芪多糖培養(yǎng)的LGG在人體胃腸道中的穩(wěn)定性，本研究通過模擬人體胃腸道環(huán)境，研究了菌種在人工胃液和人工腸液中的生長和存活情況。結(jié)果見圖2。

正常人胃液pH約為1～3，通常在2左右，食物通過胃的時間一般為1～3 h，實驗組菌株在人工胃液中處理1 h后存活率約為73.38%，2 h后存活率仍在69.22%，各時間點均高于未經(jīng)黃芪多糖處理的對照組菌株存活率。推測在胃酸和胃酶作用下，隨著時間延長，黃芪多糖出現(xiàn)一定程度降解，產(chǎn)生單糖被LGG利用。此外，在人工胃液中的存活率均高于同一pH值下MRS中的存活率，這可能是胃蛋白酶對菌體具有保護作用的緣故［9］。

2.6 人工腸液中的存活數(shù)

圖2 APS對LGG在人工胃液中存活率的影響

腸液中的膽鹽、胰蛋白酶均不利于LGG菌株的生長。食物通過小腸的平均時間約為1.5 h，模擬腸液實驗結(jié)果表明，實驗組鼠李糖乳桿菌在模擬腸液中維持2 h活菌數(shù)達到1.78×108CFU/mL，4 h后活菌數(shù)仍保持在108CFU/mL以上，符合益生菌產(chǎn)品規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。而對照組在孵育4 h后活菌數(shù)下降了1個數(shù)量級，且同一時間點實驗組發(fā)酵液中的活菌數(shù)均高于未經(jīng)APS處理的對照組。因此，經(jīng)黃芪多糖復(fù)配培養(yǎng)能提高LGG菌株在胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性。結(jié)果見表4。

表4 人工腸液中鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)

3 討論

近年來，由于環(huán)境污染、濫用藥物和膳食結(jié)構(gòu)不合理等因素，我國國民微生態(tài)營養(yǎng)狀況正受到嚴(yán)重威脅。尤其濫用抗菌藥物，使人體腸道微生態(tài)平衡受到嚴(yán)重破壞，進而引發(fā)諸多腸源性和非腸源性疾病［10］。鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵過程中只產(chǎn)生L-乳酸，不會使人體產(chǎn)生不良反應(yīng)，因此被國際公認(rèn)為最安全的菌種［11］，但其制劑在制備過程中容易失活，且經(jīng)口腔進入機體在胃腸道環(huán)境中會遭到破壞。國內(nèi)外普遍認(rèn)為活菌制劑在臨床使用時至少需要達到1×106～1×107CFU/（g·mL）的活菌數(shù)［12］。因此LGG的高存活性和高穩(wěn)定性始終是制劑的巨大挑戰(zhàn)。

已有研究表明，黃芪水煎液能促進益生菌增殖［3］。作為黃芪最重要的活性成分，黃芪多糖具有改善動物胃腸道微生態(tài)平衡、抑制有害菌、扶植有益菌等作用。為促進鼠李糖乳桿菌（LGG）增殖，提高LGG制劑的穩(wěn)定性和對不良環(huán)境的耐受能力，本文以黃芪多糖為促生因子，探究其對鼠李糖乳桿菌增殖的影響，初步證明了黃芪多糖能夠促進鼠李糖乳桿菌增殖，提高其在胃腸道中轉(zhuǎn)運時的耐受性，為開發(fā)黃芪多糖/鼠李糖乳桿菌中藥微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。而APS對LGG促生長作用的構(gòu)效關(guān)系，有待在今后的研究中進一步解析并闡明。