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        硫化氫對順鉑誘導近端腎小管上皮細胞凋亡的干預研究*

        2018-09-17 11:32:22楊波倪倩朱艷趙歡順楊成段紹斌蔣云生
        中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2018年25期
        關鍵詞:劑量

        楊波,倪倩,朱艷,趙歡順,楊成,段紹斌,蔣云生

        (1.南華大學附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科,湖南 衡陽 421001;2.長沙醫(yī)學院 臨床系,湖南 長沙 410219;3.中南大學湘雅二醫(yī)院 腎內(nèi)科,湖南 長沙 410011)

        硫化氫(sulfuretted hydrogen,H2S)目前被譽為除一氧化氮和一氧化碳的體內(nèi)第3種氣體分子,其在多種生理病理過程中擔任著重要的角色,具有調(diào)節(jié)突觸活動、舒張血管及抑制紅細胞氧化等重要生理功能。H2S可直接清除過氧化氫和超氧陰離子,具有強大的抗氧化功能。在機體內(nèi),H2S的功能多樣,包括對抗化學性損傷,抑制化學性損傷所致心肌細胞和神經(jīng)細胞的凋亡作用[1]。

        順鉑(Cisplatinum,DDP)是廣泛用于人類腫瘤化療的一種藥物,其抗腫瘤細胞作用主要是因為其與增值細胞DNA的結合特性。然而順鉑又與許多正常細胞有親和性,從而導致毒性,比如腎毒性、神經(jīng)毒性、耳毒性、催吐性[2-3],故其在化療治療中因其諸多的副作用被限制使用。而在這些副作用中,腎毒性被認為是限制其臨床應用的主要方面[4-5]。使用高劑量順鉑化療患者,20%出現(xiàn)腎功能不全,順鉑導致的腎毒性主要表現(xiàn)在小管間質(zhì)性損害[2-3]。在動物模型中,順鉑主要損害近端小管。由于順鉑在腫瘤化療中的重要地位,有很多研究尋找相應保護方法以減輕其腎毒性。在臨床前期研究中,提示抗氧化劑可以減少順鉑導致的腎毒性。

        H2S對于順鉑導致的近端腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cell,HK-2細胞)是否有保護作用,目前尚未見報道。本實驗用H2S進行干預,探索其對HK-2細胞是否有抗凋亡的作用,以尋求抗細胞凋亡的新途徑。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        正常人近端腎小管上皮細胞株(HK-2細胞)(美國ATCC公司),胎牛血清為四季青(浙江天杭生物科技股份有限公司),DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),二甲基亞砜(Dmethyl sulfoxide,DMSO)(美國Sigma公司),順鉑為諾欣(江蘇豪森藥業(yè)股份有限)公司,硫氫化鈉NaHS(上海紫一試劑廠)。噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](美國Amresco公司),Annexin V-FITC/PI試劑盒(上海前程生物科技有限公司),4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),6、24和96孔細胞培養(yǎng)板(美國Coring公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 DDP、NaHS的配置 將DDP配制成1 mg/ml溶液,過濾除菌分裝,置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩aHS配制成16 mmol/L溶液,過濾除菌分裝,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 MTT實驗 ①陰性對照組:加入等體積培養(yǎng)基;DDP組:0、1、2、5、10、20和40 mg/L;DDP+NaHS組:0 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.2 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.4 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.8 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+2.0 mmol/L NaHS。②將生長至對數(shù)期HK-2細胞調(diào)整密度為1×104個/ml。③加入96孔板,每孔100 μl,陰性對照組(加入等體積培養(yǎng)基)設置調(diào)零孔,對照孔,邊緣使用PBS填充。④在5%二氧化碳CO2,37℃培養(yǎng),至細胞單層鋪滿孔底(24 h),加入上述梯度濃度藥物,每孔100 μl,設立5個復孔。⑤每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。⑥終止培養(yǎng),吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,使用PBS清洗2、3遍。⑦每孔加入100 μl DMSO,酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的光密度(optical density,OD)值。細胞存活率(%)=(實驗孔OD均值-空白孔OD均值)/(對照孔OD均值-空白孔OD均值)×100%。

        1.2.3 DAPI、Annexin V/PI染色檢測HK-2細胞形態(tài)學變化 ①調(diào)整HK-2細胞密度為1×105個/ml,接種于24孔板(板底鋪蓋玻片),每孔1 ml。②待細胞貼壁后,根據(jù)實驗分組,予以不同干預,設3個復孔,培養(yǎng)24 h。③吸棄上清,使用PBS清洗3遍。④使用雙蒸水稀釋,將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer工作液,每孔加500 μl工作液重懸細胞。⑤每孔加入 2.5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI,1 μl DAPI。⑥輕柔渦旋混勻,室溫避光5 min。⑦使用熒光顯微鏡觀察。

        1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡率 ①調(diào)整HK-2細胞密度為5×105個/ml,接種于6孔板,每孔2 ml。②待細胞貼壁后,根據(jù)實驗分組,予以不同干預,并設置不加干預因素的流式對照,一組無染色劑,一組只有Annexin V-FITC,一組只加PI,每組設3個復孔,培養(yǎng)24 h。③培養(yǎng)結束,使用胰酶消化,1 000 r/min離心5 min,棄上清,使用PBS清洗2遍。④使用雙蒸水稀釋,將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer工作液,每管加500 μl工作液重懸細胞,調(diào)整細胞密度為5×105個/ml。⑤每管加入2.5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI。⑥輕柔渦旋混勻,室溫避光5 min。⑦進行流式細胞術分析。

        1.3 統(tǒng)計學方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用單位因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 各組的OD值比較

        使用0~40 mg/L順鉑對細胞進行處理,結果顯示:各組的OD值比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=7.969,P=0.000)。20 mg/L DDP組與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.640,P =0.007)。而加用NaHS后,細胞的OD值有所上升,呈劑量改變,在NaHS為0.5 mmol/L時差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.741,P =0.001)。但當NaHS濃度為0.5~1.0 mmol/L,3組間OD值差異無統(tǒng)計學意義(t=0.024,P =0.977)。當NaHS為2.0 mmol/L時,OD值較1.0 mmol/L下降(t=3.785,P =0.005)。

        2.2 各組HK-2細胞凋亡比較

        熒光顯微鏡下,20 mg/L DDP和HK-2細胞作用24 h后,出現(xiàn)凋亡小體,表現(xiàn)為核固縮,核碎裂,形成大小不等的染色小體,但其包膜完整。DAPI染色即顯示出染色加深,Annexin-V FITC將凋亡細胞細胞膜染色成綠色(早期凋亡),PI可將核染色成紅色(晚期凋亡)。當加入NaHS后,與DDP組比較,凋亡細胞減少,成劑量依賴性,濃度越大,凋亡細胞越少。20 mg/L DDP組平均凋亡細胞,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=-14.130,P =0.000)。加入NaHS后,隨濃度上升凋亡細胞減少,1.0 mmol/L NaHS+20 mg/L DDP組與20 mg/L DDP組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=11.121,P =0.000)。見圖1、2和表1。

        2.3 各組細胞凋亡率比較

        活細胞FITC/PI均為低染(位于左下區(qū)),凋亡細胞FITC高染而PI低染(位于右下區(qū)),壞死細胞FITC/PI均高染(位于右上區(qū))。DDP組凋亡率與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=11.121,P =0.000)。DDP組高于陰性對照組。加NaHS后,凋亡率下降,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.320,P =0.001)。隨著NaHS濃度增大,凋亡率降低,20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組與20 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS組比較,凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(t=4.568,P =0.010)。見表2和圖3。

        圖1 NaHS、DDP對HK-2細胞凋亡的影響 (DAPI染色×400)

        圖2 NaHS、DDP對HK-2細胞凋亡的影響 (Annexin V/PI染色×400)

        表1 DDP、NaHS對HK-2細胞凋亡的影響(n=8,個,±s)

        表1 DDP、NaHS對HK-2細胞凋亡的影響(n=8,個,±s)

        組別 凋亡細胞陰性對照組 4.23±1.015 20 mg/L DDP組 35.02±6.079 20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS組 22.55±2.912 20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組 9.78±2.063 F值 119.353 P值 0.000

        表2 NaHS、DDP對HK-2細胞增殖的影響(n=3,±s)

        表2 NaHS、DDP對HK-2細胞增殖的影響(n=3,±s)

        組別NaHS/(mmol/L)凋亡率/%陰性對照組 0 5.167±0.612 20 mg/L DDP組 0 31.598±1.014 20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS組 0.5 18.375±2.239 20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組 1.0 11.636±1.233 F值 193.344 P值 0.000

        圖3 NaHS、DDP對HK-2細胞凋亡的影響

        3 討論

        腎臟疾病作為多發(fā)病和常見疾病,有很高的患病率。有最新的流行病學資料顯示,我國慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患病率為10.8%。原發(fā)或繼發(fā)性因素引起急性或慢性腎損傷。當病程超過3個月,則變?yōu)椴豢赡娴穆阅I衰竭。WHO稱每年新增腫瘤患者1 400萬。20世紀70年代以來,DDP已被廣泛用于治療多種惡性腫瘤,其中包括睪丸癌、膀胱癌、宮頸癌、卵巢癌、頭頸部惡性腫瘤,以及小細胞和非小細胞肺癌等,是治療實體腫瘤最有效和常用的臨床藥物之一。但由于對正常組織中的嚴重不良反應常限制了其臨床應用。DDP不良反應有腎毒性、耳毒性、骨髓抑制、胃腸道毒性、變態(tài)反應等[6-7],其中腎毒性最常見,約1/3患者出現(xiàn)急性腎損傷[6,8-9],其劑量相關的腎毒性極大限制了臨床應用。腎臟毒性主要發(fā)生在腎臟近端小管上皮細胞,神經(jīng)毒性主要影響神經(jīng)上下級,耳毒性主要影響耳蝸中掌握機械感覺的外毛細胞。這些都大大限制了DDP的應用。腎臟損傷常常發(fā)生于使用標準處方量的DDP治療幾天后[10-14],血清肌酐和血清尿素氮水平有所增加。這種腎臟損害可以導致陽離子的浪費,進而發(fā)生糖尿和蛋白尿。DDP治療過程中最常發(fā)生的并發(fā)癥是低鎂血癥。在持續(xù)DDP治療中,可能會發(fā)生進展性和永久性腎臟損害。目前有不少學者正在研究DDP的腎毒性發(fā)生機制,尋找防治方法及藥物。

        H2S是一種有毒氣體,其無色、易溶于水,帶有特殊氣味。其在1777年由一個年輕的瑞典藥商命名,在后來的幾百年都被認為是一種有毒的氣體。它的最大暴露值(PEL)為10 ppm,當濃度<400 ppm時可以導致人驟然死亡?,F(xiàn)在H2S被認為是第3種氣體分子。半胱氨酸的脫巰基酶是哺乳動物H2S的主要來源。該過程是被CBS和CSE催化。CBS在大腦中的很多區(qū)域表達,特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15-16]。而CSE主要在循環(huán)系統(tǒng)表達[17]。文獻指出,H2S對神經(jīng)系統(tǒng)保護[18-19]、循環(huán)系統(tǒng)保護[20-21]都有很多作用。H2S被認為的主要機制是抗氧化作用,這也是研究的一大熱點。H2S是強大抗氧化劑,可保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,有時也是強大的促氧化劑,可以通過ROS活化殺滅腫瘤細胞[22]。它被發(fā)現(xiàn)有兩個截然不同的分子機制,抗氧化性和促氧化性,而表現(xiàn)出哪個方面,取決于當時的內(nèi)環(huán)境。簡單歸納說,H2S可以表現(xiàn)出很多益處,比如對心血管系統(tǒng)的保護作用。而更深層次地說,還可以表現(xiàn)出毒性/細胞毒性效應。

        通過研究發(fā)現(xiàn),H2S參與氧化應激效應并不是通過單純的機制,其中有多種信號通路參與。H2S可以通過多種酶類或者非酶類的抗氧化劑清除自由基。H2S也會抑制線粒體ROS產(chǎn)生,通過抑制p66Shc巰基。也可以通過它的化學特性減少氧自由基,其機制十分復雜。

        本實驗MTT比色法檢測DDP的濃度與HK-2細胞培養(yǎng),隨DDP濃度上升,OD逐漸下降,示細胞凋亡增加,發(fā)現(xiàn)在DDP為20 mg/L時,細胞生長被抑制,顯示DDP對HK-2細胞的毒性作用,隨劑量增加而加重,與劑量呈正相關。在DDP為20 mg/L聯(lián)合使用NaHS后,細胞凋亡減少,并且NaHS上升后,細胞凋亡逐漸減少。提示H2S可以減輕DDP對細胞的毒害,并且與濃度有關。但在NaHS<1 mmol/L時,對HK-2細胞的保護作用下降,NaHS保護作用下降的機制有待進一步研究。

        在DAPI染色和Annexin V-FITC/PI染色,早期凋亡會出現(xiàn)細胞膜被染成綠色,晚期凋亡則是胞核也可以被染成紅色。實驗顯示見DDP組的細胞凋亡率高于陰性對照組,在加用NaHS后,凋亡率有所下降,并且與劑量相關。Annexin V-FITC/PI流式細胞術可更準確地反映凋亡情況,可在不同象限更直觀精確地反映。在流式細胞術中,可以明顯看見DDP組凋亡,而加用NaHS后,凋亡明顯減少,呈劑量依賴性。

        氧化還原系統(tǒng)的平衡,對細胞的生存能力和功能有至關重要的作用,是由兩個抗氧化系統(tǒng)組成(谷胱甘肽系統(tǒng)和硫氧還蛋白系統(tǒng))組成的?;钚匝跸盗惺羌毎玛惔x正常副產(chǎn)物,比如線粒體新陳代謝或者蛋白質(zhì)折疊均可產(chǎn)生。硫氧還原蛋白系統(tǒng),包括硫氧還原蛋白、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),在細胞氧化還原信號轉導里扮演著一個重要的角色生長和細胞凋亡。除了氧化還原調(diào)控胞內(nèi)信號,系統(tǒng)也發(fā)揮其直接抗氧化防御氧化應激,包括清除活性氧(ROS),減少過氧化物和內(nèi)源性抗氧化劑回收。DDP導致的細胞凋亡和ROS導致的p53活化有關,而H2S也會抑制線粒體ROS產(chǎn)生,通過抑制p66Shc巰基。但是H2S是否是通過這個通路來抑制DDP對細胞的毒性,仍需進一步研究。當NaHS濃度<1 mmol/L時,對細胞的保護作用下降,可能與此有關。

        DDP導致的腎損傷機制涉及多種途徑,如炎癥介質(zhì)、氧化應激、壞死及凋亡、自噬等,目前仍不清楚這些因素最終整合導致腎損傷的具體機制。本實驗顯示H2S對DDP導致的HK-2細胞凋亡有保護作用,但是在人體內(nèi),機制仍不清楚。且需要考慮內(nèi)源性H2S的作用及藥物的分布等。因此對于其進一步應用,須繼續(xù)大量體外及體內(nèi)實驗觀察。進一步研究既保護正常組織,又不影響DDP抗腫瘤治療的方法,將有助于DDP在臨床抗腫瘤治療中的廣泛應用。

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