楊波，倪倩，朱艷，趙歡順，楊成，段紹斌，蔣云生

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2.長沙醫(yī)學院 臨床系，湖南 長沙 410219；3.中南大學湘雅二醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖南 長沙 410011）

硫化氫（sulfuretted hydrogen,H2S）目前被譽為除一氧化氮和一氧化碳的體內(nèi)第3種氣體分子，其在多種生理病理過程中擔任著重要的角色，具有調(diào)節(jié)突觸活動、舒張血管及抑制紅細胞氧化等重要生理功能。H2S可直接清除過氧化氫和超氧陰離子，具有強大的抗氧化功能。在機體內(nèi)，H2S的功能多樣，包括對抗化學性損傷，抑制化學性損傷所致心肌細胞和神經(jīng)細胞的凋亡作用[1]。

順鉑（Cisplatinum,DDP）是廣泛用于人類腫瘤化療的一種藥物，其抗腫瘤細胞作用主要是因為其與增值細胞DNA的結合特性。然而順鉑又與許多正常細胞有親和性，從而導致毒性，比如腎毒性、神經(jīng)毒性、耳毒性、催吐性[2-3]，故其在化療治療中因其諸多的副作用被限制使用。而在這些副作用中，腎毒性被認為是限制其臨床應用的主要方面[4-5]。使用高劑量順鉑化療患者，20%出現(xiàn)腎功能不全，順鉑導致的腎毒性主要表現(xiàn)在小管間質(zhì)性損害[2-3]。在動物模型中，順鉑主要損害近端小管。由于順鉑在腫瘤化療中的重要地位，有很多研究尋找相應保護方法以減輕其腎毒性。在臨床前期研究中，提示抗氧化劑可以減少順鉑導致的腎毒性。

H2S對于順鉑導致的近端腎小管上皮細胞（human renal tubular epithelial cell,HK-2細胞）是否有保護作用，目前尚未見報道。本實驗用H2S進行干預，探索其對HK-2細胞是否有抗凋亡的作用，以尋求抗細胞凋亡的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

正常人近端腎小管上皮細胞株（HK-2細胞）（美國ATCC公司），胎牛血清為四季青（浙江天杭生物科技股份有限公司），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），二甲基亞砜（Dmethyl sulfoxide,DMSO）（美國Sigma公司），順鉑為諾欣（江蘇豪森藥業(yè)股份有限）公司，硫氫化鈉NaHS（上海紫一試劑廠）。噻唑藍[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]（美國Amresco公司），Annexin V-FITC/PI試劑盒（上海前程生物科技有限公司），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），6、24和96孔細胞培養(yǎng)板（美國Coring公司）。

1.2 方法

1.2.1 DDP、NaHS的配置 將DDP配制成1 mg/ml溶液，過濾除菌分裝，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩aHS配制成16 mmol/L溶液，過濾除菌分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MTT實驗 ①陰性對照組：加入等體積培養(yǎng)基；DDP組：0、1、2、5、10、20和40 mg/L；DDP+NaHS組：0 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.2 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.4 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.8 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+2.0 mmol/L NaHS。②將生長至對數(shù)期HK-2細胞調(diào)整密度為1×104個/ml。③加入96孔板，每孔100 μl，陰性對照組（加入等體積培養(yǎng)基）設置調(diào)零孔，對照孔，邊緣使用PBS填充。④在5%二氧化碳CO2，37℃培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底（24 h），加入上述梯度濃度藥物，每孔100 μl，設立5個復孔。⑤每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。⑥終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，使用PBS清洗2、3遍。⑦每孔加入100 μl DMSO，酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的光密度（optical density,OD）值。細胞存活率（%）=（實驗孔OD均值-空白孔OD均值）/（對照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。

1.2.3 DAPI、Annexin V/PI染色檢測HK-2細胞形態(tài)學變化 ①調(diào)整HK-2細胞密度為1×105個/ml，接種于24孔板（板底鋪蓋玻片），每孔1 ml。②待細胞貼壁后，根據(jù)實驗分組，予以不同干預，設3個復孔，培養(yǎng)24 h。③吸棄上清，使用PBS清洗3遍。④使用雙蒸水稀釋，將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer工作液，每孔加500 μl工作液重懸細胞。⑤每孔加入 2.5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，1 μl DAPI。⑥輕柔渦旋混勻，室溫避光5 min。⑦使用熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡率 ①調(diào)整HK-2細胞密度為5×105個/ml，接種于6孔板，每孔2 ml。②待細胞貼壁后，根據(jù)實驗分組，予以不同干預，并設置不加干預因素的流式對照，一組無染色劑，一組只有Annexin V-FITC，一組只加PI，每組設3個復孔，培養(yǎng)24 h。③培養(yǎng)結束，使用胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，使用PBS清洗2遍。④使用雙蒸水稀釋，將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer工作液，每管加500 μl工作液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×105個/ml。⑤每管加入2.5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI。⑥輕柔渦旋混勻，室溫避光5 min。⑦進行流式細胞術分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單位因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組的OD值比較

使用0～40 mg/L順鉑對細胞進行處理，結果顯示：各組的OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=7.969，P=0.000）。20 mg/L DDP組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.640，P =0.007）。而加用NaHS后，細胞的OD值有所上升，呈劑量改變，在NaHS為0.5 mmol/L時差異有統(tǒng)計學意義（t=-4.741，P =0.001）。但當NaHS濃度為0.5～1.0 mmol/L，3組間OD值差異無統(tǒng)計學意義（t=0.024，P =0.977）。當NaHS為2.0 mmol/L時，OD值較1.0 mmol/L下降（t=3.785，P =0.005）。

2.2 各組HK-2細胞凋亡比較

熒光顯微鏡下，20 mg/L DDP和HK-2細胞作用24 h后，出現(xiàn)凋亡小體，表現(xiàn)為核固縮，核碎裂，形成大小不等的染色小體，但其包膜完整。DAPI染色即顯示出染色加深，Annexin-V FITC將凋亡細胞細胞膜染色成綠色（早期凋亡），PI可將核染色成紅色（晚期凋亡）。當加入NaHS后，與DDP組比較，凋亡細胞減少，成劑量依賴性，濃度越大，凋亡細胞越少。20 mg/L DDP組平均凋亡細胞，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=-14.130，P =0.000）。加入NaHS后，隨濃度上升凋亡細胞減少，1.0 mmol/L NaHS+20 mg/L DDP組與20 mg/L DDP組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=11.121，P =0.000）。見圖1、2和表1。

2.3 各組細胞凋亡率比較

活細胞FITC/PI均為低染（位于左下區(qū)），凋亡細胞FITC高染而PI低染（位于右下區(qū)），壞死細胞FITC/PI均高染（位于右上區(qū)）。DDP組凋亡率與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.121，P =0.000）。DDP組高于陰性對照組。加NaHS后，凋亡率下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.320，P =0.001）。隨著NaHS濃度增大，凋亡率降低，20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組與20 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS組比較，凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（t=4.568，P =0.010）。見表2和圖3。

圖1 NaHS、DDP對HK-2細胞凋亡的影響 （DAPI染色×400）

圖2 NaHS、DDP對HK-2細胞凋亡的影響 （Annexin V/PI染色×400）

表1 DDP、NaHS對HK-2細胞凋亡的影響（n=8，個，±s）

表1 DDP、NaHS對HK-2細胞凋亡的影響（n=8，個，±s）

組別 凋亡細胞陰性對照組 4.23±1.015 20 mg/L DDP組 35.02±6.079 20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS組 22.55±2.912 20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組 9.78±2.063 F值 119.353 P值 0.000

表2 NaHS、DDP對HK-2細胞增殖的影響（n=3，±s）

表2 NaHS、DDP對HK-2細胞增殖的影響（n=3，±s）

組別NaHS/（mmol/L）凋亡率/%陰性對照組 0 5.167±0.612 20 mg/L DDP組 0 31.598±1.014 20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS組 0.5 18.375±2.239 20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組 1.0 11.636±1.233 F值 193.344 P值 0.000

圖3 NaHS、DDP對HK-2細胞凋亡的影響

3 討論

腎臟疾病作為多發(fā)病和常見疾病，有很高的患病率。有最新的流行病學資料顯示，我國慢性腎臟病（chronic kidney disease,CKD）患病率為10.8%。原發(fā)或繼發(fā)性因素引起急性或慢性腎損傷。當病程超過3個月，則變?yōu)椴豢赡娴穆阅I衰竭。WHO稱每年新增腫瘤患者1 400萬。20世紀70年代以來，DDP已被廣泛用于治療多種惡性腫瘤，其中包括睪丸癌、膀胱癌、宮頸癌、卵巢癌、頭頸部惡性腫瘤，以及小細胞和非小細胞肺癌等，是治療實體腫瘤最有效和常用的臨床藥物之一。但由于對正常組織中的嚴重不良反應常限制了其臨床應用。DDP不良反應有腎毒性、耳毒性、骨髓抑制、胃腸道毒性、變態(tài)反應等[6-7]，其中腎毒性最常見，約1/3患者出現(xiàn)急性腎損傷[6，8-9]，其劑量相關的腎毒性極大限制了臨床應用。腎臟毒性主要發(fā)生在腎臟近端小管上皮細胞，神經(jīng)毒性主要影響神經(jīng)上下級，耳毒性主要影響耳蝸中掌握機械感覺的外毛細胞。這些都大大限制了DDP的應用。腎臟損傷常常發(fā)生于使用標準處方量的DDP治療幾天后[10-14]，血清肌酐和血清尿素氮水平有所增加。這種腎臟損害可以導致陽離子的浪費，進而發(fā)生糖尿和蛋白尿。DDP治療過程中最常發(fā)生的并發(fā)癥是低鎂血癥。在持續(xù)DDP治療中，可能會發(fā)生進展性和永久性腎臟損害。目前有不少學者正在研究DDP的腎毒性發(fā)生機制，尋找防治方法及藥物。

H2S是一種有毒氣體，其無色、易溶于水，帶有特殊氣味。其在1777年由一個年輕的瑞典藥商命名，在后來的幾百年都被認為是一種有毒的氣體。它的最大暴露值（PEL）為10 ppm，當濃度＜400 ppm時可以導致人驟然死亡?，F(xiàn)在H2S被認為是第3種氣體分子。半胱氨酸的脫巰基酶是哺乳動物H2S的主要來源。該過程是被CBS和CSE催化。CBS在大腦中的很多區(qū)域表達，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15-16]。而CSE主要在循環(huán)系統(tǒng)表達[17]。文獻指出，H2S對神經(jīng)系統(tǒng)保護[18-19]、循環(huán)系統(tǒng)保護[20-21]都有很多作用。H2S被認為的主要機制是抗氧化作用，這也是研究的一大熱點。H2S是強大抗氧化劑，可保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，有時也是強大的促氧化劑，可以通過ROS活化殺滅腫瘤細胞[22]。它被發(fā)現(xiàn)有兩個截然不同的分子機制，抗氧化性和促氧化性，而表現(xiàn)出哪個方面，取決于當時的內(nèi)環(huán)境。簡單歸納說，H2S可以表現(xiàn)出很多益處，比如對心血管系統(tǒng)的保護作用。而更深層次地說，還可以表現(xiàn)出毒性/細胞毒性效應。

通過研究發(fā)現(xiàn)，H2S參與氧化應激效應并不是通過單純的機制，其中有多種信號通路參與。H2S可以通過多種酶類或者非酶類的抗氧化劑清除自由基。H2S也會抑制線粒體ROS產(chǎn)生，通過抑制p66Shc巰基。也可以通過它的化學特性減少氧自由基，其機制十分復雜。

本實驗MTT比色法檢測DDP的濃度與HK-2細胞培養(yǎng)，隨DDP濃度上升，OD逐漸下降，示細胞凋亡增加，發(fā)現(xiàn)在DDP為20 mg/L時，細胞生長被抑制，顯示DDP對HK-2細胞的毒性作用，隨劑量增加而加重，與劑量呈正相關。在DDP為20 mg/L聯(lián)合使用NaHS后，細胞凋亡減少，并且NaHS上升后，細胞凋亡逐漸減少。提示H2S可以減輕DDP對細胞的毒害，并且與濃度有關。但在NaHS＜1 mmol/L時，對HK-2細胞的保護作用下降，NaHS保護作用下降的機制有待進一步研究。

在DAPI染色和Annexin V-FITC/PI染色，早期凋亡會出現(xiàn)細胞膜被染成綠色，晚期凋亡則是胞核也可以被染成紅色。實驗顯示見DDP組的細胞凋亡率高于陰性對照組，在加用NaHS后，凋亡率有所下降，并且與劑量相關。Annexin V-FITC/PI流式細胞術可更準確地反映凋亡情況，可在不同象限更直觀精確地反映。在流式細胞術中，可以明顯看見DDP組凋亡，而加用NaHS后，凋亡明顯減少，呈劑量依賴性。

氧化還原系統(tǒng)的平衡，對細胞的生存能力和功能有至關重要的作用，是由兩個抗氧化系統(tǒng)組成（谷胱甘肽系統(tǒng)和硫氧還蛋白系統(tǒng)）組成的?；钚匝跸盗惺羌毎玛惔x正常副產(chǎn)物，比如線粒體新陳代謝或者蛋白質(zhì)折疊均可產(chǎn)生。硫氧還原蛋白系統(tǒng)，包括硫氧還原蛋白、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在細胞氧化還原信號轉導里扮演著一個重要的角色生長和細胞凋亡。除了氧化還原調(diào)控胞內(nèi)信號，系統(tǒng)也發(fā)揮其直接抗氧化防御氧化應激，包括清除活性氧（ROS），減少過氧化物和內(nèi)源性抗氧化劑回收。DDP導致的細胞凋亡和ROS導致的p53活化有關，而H2S也會抑制線粒體ROS產(chǎn)生，通過抑制p66Shc巰基。但是H2S是否是通過這個通路來抑制DDP對細胞的毒性，仍需進一步研究。當NaHS濃度＜1 mmol/L時，對細胞的保護作用下降，可能與此有關。

DDP導致的腎損傷機制涉及多種途徑，如炎癥介質(zhì)、氧化應激、壞死及凋亡、自噬等，目前仍不清楚這些因素最終整合導致腎損傷的具體機制。本實驗顯示H2S對DDP導致的HK-2細胞凋亡有保護作用，但是在人體內(nèi)，機制仍不清楚。且需要考慮內(nèi)源性H2S的作用及藥物的分布等。因此對于其進一步應用，須繼續(xù)大量體外及體內(nèi)實驗觀察。進一步研究既保護正常組織，又不影響DDP抗腫瘤治療的方法，將有助于DDP在臨床抗腫瘤治療中的廣泛應用。