孫玉金，李來傳，史有奎，高名同，徐珊珊，陳京霞

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，山東 濰坊261031）

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。哮喘病理以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑為主要特征[1]。長期慢性氣道炎癥的刺激使氣道壁發(fā)生結(jié)構(gòu)性的改變，稱為氣道重塑，主要表現(xiàn)為氣道上皮黏液化生、平滑肌肥大/增生、上皮下膠原沉積和纖維化、血管增生等[2-3]，從而使哮喘患者對吸入激素的敏感性降低，出現(xiàn)不可逆的氣流受限及持續(xù)存在的氣道高反應(yīng)性[4]。細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）均為細(xì)胞表面產(chǎn)生的免疫球蛋白，炎癥反應(yīng)時介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與血管內(nèi)皮間的黏附，是炎癥反應(yīng)形成的基礎(chǔ)[5]，因此ICAM-1、VCAM-1的水平可反映哮喘氣道炎癥水平。血必凈注射液是含有多種中藥成分的復(fù)方制劑，具有抗淤解毒、抗炎等作用，可通過不同機(jī)制調(diào)控炎癥反應(yīng)[6-7]。本研究主要通過復(fù)制小鼠哮喘模型及血必凈注射液的干預(yù)，觀察血必凈哮喘小鼠肺泡灌洗液中ICAM-1、VCAM-1水平及氣道重塑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

BABL/c小鼠40只，購自北京華阜康生物有限公司，使用許可號SYXK（魯）2013-001，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（京）2014-0004，6～8周齡，體重16～20 g，飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學(xué)院動物房，室溫25℃，濕度50%，12 h黑白交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由取水。

1.2 藥物

血必凈，天津紅日藥業(yè)有限公司，10 ml/支。

1.3 主要試劑和儀器

卵清蛋白（OVA）干粉（北京索萊寶科技有限公司），水合氯醛、PBS緩沖液、4%多聚甲醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鋁（天津博迪化工股份有限公司），ICAM-1 ELISA試劑盒、VCAM-1 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），霧化器（boy037G 6000型，Pari德國），霧化箱（自制，20 cm×20 cm×20 cm），20 ml注射器（威高集團(tuán)有限公司），HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.4 分組與模型復(fù)制

將小鼠隨機(jī)分成5組：健康對照組（C組）、慢性哮喘組（A組）、血必凈干預(yù)1周組（1組）、血必凈干預(yù)2周組（2組）和血必凈干預(yù)3周組（3組），每組8只。除對照組之外，每組小鼠均于第1、8、15天分別注射卵清蛋白混懸液OVA[含100 μg OVA，1 mg Al（OH）3]致敏，對照組用等量生理鹽水注射；從第22天開始將小鼠放入自制的霧化箱內(nèi)，除對照組外其余各組小鼠每天霧化吸入1%的OVA 15 min激發(fā)，每天吸入1次，時間20 min，霧化至第56天，小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁、毛發(fā)聳立、活動與飲食減少等癥狀為模型復(fù)制成功，復(fù)制模型總時間為8周。對照組給予相同劑量生理鹽水霧化吸入；1、2、3組從第57天開始腹腔注射血必凈注射液4 ml/（kg·d），治療時間分別為1、2、3周。

1.5 肺泡灌洗液的獲取與檢測

每只小鼠均于末次治療結(jié)束24 h后以6%水合氯醛（6 ml/kg）麻醉后處死，氣管切開，以20 ml針頭作為留置針，以BPS緩沖液行全肺灌洗，回收率為80%及以上?；厥盏姆闻莨嘞匆海╞ronchoalveolar lavage fluid,BALF）立即于3 000 r/min離心7 min，取其上清液，編號后置于-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.6 肺組織的獲取與染色

收集完BALF之后立即取肺組織，左肺葉置于-80℃液氮中保存?zhèn)溆?。右葉肺用4%的多聚甲醛固定并用石蠟包埋，制成5 μm厚切片，分別按照HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒操作說明書進(jìn)行染色。

1.7 肺泡灌洗液ICAM-1、VCAM-1的檢測

取BALF上清液以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzymelinked immuno sorbent assay,ELISA）法嚴(yán)格按照ICAM-1 ELISA試劑盒、VCAM-1 ELISA試劑盒的說明書操作，用酶聯(lián)儀在450 nm波長處測吸光度值，ICAM-1、VCAM-1的濃度與吸光度值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中ICAM-1、VCAM-1的濃度。

1.8 肺組織形態(tài)學(xué)分析

病理形態(tài)學(xué)：肺組織Masson染色顯示小鼠氣道上皮下膠原纖維沉積情況，染色成淡藍(lán)色，HE染色可觀察肺組織炎癥細(xì)胞浸潤程度及支氣管腔分泌物、黏膜褶皺水腫、氣道平滑肌及基底膜情況。氣道形態(tài)學(xué)：應(yīng)用Image Pro Pluse圖像分析軟件測定支氣管基底膜周徑（Pbm）、支氣管管壁面積（WAt）、支氣管平滑肌面積（WAm），并用Pbm標(biāo)化，WAt/Pbm表示支氣管管壁厚度，以WAm/Pbm表示支氣管平滑肌厚度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BALF中ICAM-1、VCAM-1水平比較

各組BALF中ICAM-1、VCAM-1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A組ICAM-1、VCAM-1的水平高于其余4組（P＜0.05），說明該模型復(fù)制成功；1組、2組、3組隨著血必凈干預(yù)時間延長，ICAM-1和VCAM-1的水平逐漸下調(diào)，但均高于C組（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組肺組織形態(tài)比較

與C組比較，Masson染色可見A組氣道上皮下膠原纖維沉積增多，血必凈干預(yù)的1組、2組、3組隨著干預(yù)時間延長，氣道上皮下膠原纖維沉積逐漸減少（見圖1A）；HE染色可見C組氣道壁光滑連續(xù)、無皺褶水腫，氣道管壁無明顯增厚，炎癥細(xì)胞浸潤少，A組與C組比較，氣道壁不連續(xù)，黏膜皺褶水腫增多，氣道平滑肌及基底膜明顯增厚，氣道壁周圍炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管腔分泌物增多，1組、2組、3組隨著血必凈干預(yù)時間延長，上述組織病理變化好轉(zhuǎn)（見圖1B）。

2.3 各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較

各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A組支氣管管壁厚度、平滑肌厚度厚于其余4組（P＜0.05）；1組、2組、3組支氣管管壁厚度、平滑肌厚度逐漸變薄，但均厚于C組（P＜0.05）。見表2和圖2。

表1 各組BALF中ICAM-1、VCAM-1水平比較（n=8，pg/ml，±s）

表1 各組BALF中ICAM-1、VCAM-1水平比較（n=8，pg/ml，±s）

注：1）與 A組比較，P＜0.05；2）與C組比較，P＜0.05；3）與1組比較，P＜0.05；4）與2組比較，P＜0.05

組別 ICAM-1 VCAM-1 C組 274.14±39.151） 131.80±50.881）A組 681.85±80.512） 565.27±89.612）1 組 597.43±94.041）2） 456.71±66.801）2）2 組 466.25±82.251）2）3） 343.00±66.801）2）3）3 組 349.29±36.031）2）3）4） 259.54±75.111）2）3）4）F值 45.742 45.095 P值 0.000 0.000

圖1 各組肺組織形態(tài)比較

表2 各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較（n=8，μm，±s）

表2 各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較（n=8，μm，±s）

注：1）與 A 組比較，P＜0.05；2）與 C 組比較，P＜0.05；3）與1組比較，P＜0.05；4）與2組比較，P＜0.05

組別 支氣管管壁厚度 平滑肌厚度C組 9.93±0.451） 4.33±0.131）A組 18.94±0.402） 7.06±0.282）1 組 16.97±0.151）2） 5.97±0.221）2）2 組 14.11±0.281）2）3） 5.10±0.131）2）3）3 組 11.91±0.191）2）3）4） 4.89±0.071）2）3）4）F值 1067.595 279.109 P值 0.000 0.000

圖2 各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較

3 討論

哮喘在我國的發(fā)病率為0.7%～3.8%[8]，是最常見的慢性疾病之一，有研究指出其死亡率占全球總死亡率的1/250[9]，且其發(fā)病率及死亡率呈逐年增加的趨勢[10]。

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的2個重要的病理特征。持續(xù)存在的氣道炎癥是導(dǎo)致氣道重塑的主要原因，而氣道重塑又會使患者對吸入激素的敏感性降低，出現(xiàn)不可逆的氣流受限及持續(xù)存在的氣道高反應(yīng)性，也是難治性哮喘死亡率增高的主要原因之一[4]。ICAM-1、VCAM-1均為細(xì)胞表面產(chǎn)生的免疫球蛋白，炎癥反應(yīng)時介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與血管內(nèi)皮間的黏附，是炎癥反應(yīng)形成的基礎(chǔ)[5]。VCAM-1主要在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附。ICAM-1主要分布于白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞上，主要介導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，促進(jìn)淋巴細(xì)胞聚集。ICAM-1、VCAM-1還可促進(jìn)氣道炎癥時嗜酸性粒細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)移[11]。因此，若能使黏附分子ICAM-1、VCAM-1的水平降低，減少炎癥細(xì)胞的黏附和跨內(nèi)膜遷移[12]，可有效減輕氣道炎癥，從而減輕因長期氣道炎癥引起的氣道重構(gòu)。從而從根本上提高哮喘患者的生活質(zhì)量，甚至治愈哮喘。

現(xiàn)在臨床治療中以糖皮質(zhì)激素和支氣管擴(kuò)張劑為主，佐以免疫調(diào)節(jié)藥物，側(cè)重于緩解支氣管哮喘的急性發(fā)作，但是針對氣道重塑的藥物卻很少[1，3]。并且糖皮質(zhì)激素還可以引起高血壓、高血糖、高脂血癥、骨質(zhì)疏松癥等不良反應(yīng)[13-14]，臨床中還發(fā)現(xiàn)有些哮喘患者對糖皮質(zhì)激素并不敏感[15-17]，每每遇到上述情況，臨床治療就會受到很大限制，因此尋找一種新型有效的治療哮喘的藥物正日益引起人們的關(guān)注。

血必凈是一種中藥復(fù)方制劑，由中藥紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸組成，具有活血化瘀、疏通脈絡(luò)、潰散毒邪、消除內(nèi)毒素的功能，還具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)和組織灌注的作用尤其適用于因感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)的疾病，現(xiàn)有研究表明血必凈可通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減少炎癥反應(yīng)[18-19]。有研究提出血必凈可有效改善外周血中性粒細(xì)胞的趨化[7]，但未做進(jìn)一步研究。本研究通過5組小鼠的比較發(fā)現(xiàn)血必凈可使哮喘小鼠BALF中黏附分子ICAM-1、VCAM-1水平下降，且干預(yù)時間越長，下降水平越顯著，從而有效減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。通過鏡下觀察及相關(guān)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測定證實(shí)血必凈可有效改善哮喘患者的氣道重塑。因此大膽推測血必凈或許會成為治療哮喘的新藥物，這為哮喘治療提供了新思路。