周美潔 吳軍軍 吳敏珍 祝文堅 梁宇

（廣西梧州市中心血站 廣西 梧州 543002）

2010年6月開始，國家衛(wèi)生計生委在全國進行核酸檢測試點工作，以持續(xù)提高我國血站的血液篩查技術(shù)，確保臨床輸血的安全。2016年3月1日實施的《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2015版）規(guī)定，核酸檢測正式納入到無償獻血者血液篩查的檢測方法中。作為ELISA法血液檢測的有益補充，NAT有效縮短了病毒檢測窗口期，降低輸血傳播傳播病原體的殘余風(fēng)險，特別是對于隱匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）的檢出發(fā)揮了重要作用[1]。我站于2014年12月開始對部分獻血者血液標(biāo)本進行核酸檢測，2015年10月全面對獻血者血液進行核酸篩查，本文對梧州地區(qū)2015年1月至2017年8月38496份無償獻血者血液核酸檢測HBV篩查結(jié)果進行分析，現(xiàn)報告如下。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2015年1月至2017年8月梧州市中心血站無償獻血者血液標(biāo)本38496人份，每次獻血者同時留取兩份血液標(biāo)本，分別用于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和核酸檢測（NTA）。根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》要求，核酸標(biāo)本需要在采集4h內(nèi)3500×g離心15min，2～8℃冰箱保存，72小時內(nèi)完成檢測，如因特殊情況72小時內(nèi)不能完成檢測的，離心后24小時內(nèi)在-20℃以下凍存。血液標(biāo)本的標(biāo)識、包裝和運輸過程符合國家相關(guān)要求。

1.2 儀器與試劑酶免檢測儀器

TECAN SCHWEIZ公司全自動酶免工作站TECAN FREEDOM EVOLYZER-2200；瑞士HAMILITON公司Microlab FAME全自動酶聯(lián)檢測分析儀；核酸檢測儀器：美國諾華公司Procleix TIGRIS SYSTEM核酸檢測系統(tǒng)（轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)-TMA），美國CHIRON公司試劑孵育儀RPI，ELGA純處理水系統(tǒng)。ELISA檢測試劑：北京萬泰乙肝表面抗原診斷試劑盒，珠海麗珠乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒；NAT試劑：美國諾華公司的HBV、HCV、HIV-1NAT試劑盒（TMA法）。所有試驗試劑經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)，每批試劑經(jīng)過質(zhì)量抽檢，并進行確認(rèn)合格后使用。

1.3 方法

對無償獻血者的標(biāo)本同步進行酶免試驗和核酸檢測。ELISA試驗：由酶免實驗室檢測人員嚴(yán)格遵照實驗室操作規(guī)程，采用2種不同的試劑對樣本進行HBSAg檢測，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：S/CO≥1為陽性，判斷結(jié)果為不合格，對血液進行隔離報廢；NAT檢測：由核酸實驗室工作人員采用全自動核酸檢測系統(tǒng)及配套試劑盒（TMA-化學(xué)發(fā)光法）對血液同步進行HBV、HCV、HIV-1核酸聯(lián)合檢測，若血樣核酸聯(lián)合檢測呈陽性反應(yīng)，且ELISA檢測HBSAg陽性，則認(rèn)為核酸檢測HBV-DNA呈反應(yīng)性，不需繼續(xù)進行后續(xù)的核酸鑒別試驗。對核酸聯(lián)合檢測呈反應(yīng)性而ELISA檢測HBSAg陰性的標(biāo)本進行HBV、HCV、HIV-1核酸鑒別檢測，任一項呈反應(yīng)性，判斷為陽性。留取HBV-DNA陽性標(biāo)本血清1ml，送梧州市某三級醫(yī)院進行乙肝血清標(biāo)志物五項檢測。對HBsAg陰性而HBV-DNA陽性獻血者進行隨訪，2個月后采集其血樣進行HBsAg和HBV-DNA復(fù)檢，留取血清送檢乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物五項。在后續(xù)檢測中HBV-DNA持續(xù)陽性，HBsAg發(fā)生陽性轉(zhuǎn)化則定為HBV免疫“窗口期”；后續(xù)檢測HBsAg仍為陰性，而HBV-DNA持續(xù)陽性和/或抗-HBc和/或抗-HBs陽性，則定為“隱匿性”HBV感染。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

對本站38496份無償獻血者血液HBV篩查結(jié)果進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 同步進行ELISA和NAT篩查的38496份無償獻血者血液中，采用血清學(xué)ELISA法檢測HBsAg陽性，且HBV、HCV、HIV-1核酸聯(lián)合檢測陽性樣本共132例，占全部樣本的0.34%（132/38496），即血清學(xué)檢測乙型肝炎病毒的陽性檢出率為0.34%；對271例ELISA結(jié)果為陰性、NAT聯(lián)合檢測結(jié)果為陽性的樣本進行鑒別實驗，HBV-DNA陽性樣本數(shù)101例，占全部樣本的0.26%(101/38496)，即ELISA檢測乙型肝炎病毒的漏檢率2.6‰，病毒核酸檢測乙型肝炎病毒的陽性檢出率為0.61%(233/38496)。兩種檢測方法HBV陽性率比較見表1。

表1 兩種檢測方法HBV陽性率比較

2.2 82 例初次酶免實驗HBsAg陰性而核酸檢測HBV-DNA陽性標(biāo)本送醫(yī)院實驗室進行乙型肝炎五項檢測（化學(xué)發(fā)光法），其中抗-HBc陽性64例（占78.04%），抗-HBs陽性34例（占41.46%），抗-HBe陽性21例（25.61%占），HBeAg均為陰性，結(jié)果見表2。

表2 82例HBV-DNA陽性標(biāo)本初次送檢乙肝五項檢測結(jié)果

2.3 對22例初次酶免實驗HBsAg陰性而核酸檢測HBV-DNA陽性的獻血者進行隨訪，2個月后追蹤檢測的結(jié)果顯示：16例追蹤樣本仍為HBV-DNA陽性，判定為隱匿性乙肝；6例追蹤樣本檢測HBV-DNA陰性，懷疑初檢HBV-DNA假陽性或病毒載量過低未檢出；未發(fā)現(xiàn)后續(xù)檢測中發(fā)生HBsAg陽性轉(zhuǎn)化標(biāo)本。

3.討論

隱匿性乙肝感染是酶免檢測主要的漏檢原因之一[2]，大量證據(jù)表明，隱匿性HBV感染的血液可引起HBV經(jīng)輸血傳播[3]。目前，NAT技術(shù)在我國已經(jīng)全面覆蓋應(yīng)用到無償獻血者血液篩查中。通過本次研究發(fā)現(xiàn)：（1）我站完成38496份獻血者樣本中，血清學(xué)檢測乙型肝炎病毒的陽性檢出率為0.34%，病毒核酸檢測乙型肝炎病毒的陽性檢出率為0.61%；ELISA檢測乙型肝炎病毒的漏檢率2.6‰。核酸檢測HBV陽性率與ELISA檢測陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），證實了核酸檢測可以很大程度上提高HBV的檢出率，降低了ELISA方法檢測漏洞的風(fēng)險。（2）根據(jù)HBsAg陰性、核酸檢測HBV-DNA陽性標(biāo)本乙型肝炎五項檢測結(jié)果顯示，大多數(shù)抗-HBc為陽性，建議在獻血者血液篩查中，血清學(xué)檢測增加抗-HBc項目，這樣可以在一定程度上降低乙肝病毒漏檢的風(fēng)險。（3）在追蹤隨訪的樣本中，6例HBV-DNA后續(xù)檢測呈陰性反應(yīng)，懷疑部分標(biāo)本初次核酸檢測為假陽性，也可能因為病毒復(fù)制和表達水平過低或宿主方面等的因素導(dǎo)致病毒未能檢出；未發(fā)現(xiàn)后續(xù)檢測中發(fā)生HBsAg陽性轉(zhuǎn)化標(biāo)本，即未發(fā)現(xiàn)HBV“窗口期”感染，可能酶免試劑的靈敏度、本次研究樣本量大小等因素有關(guān)，需持續(xù)提高檢測質(zhì)量，繼續(xù)對以后檢出陽性樣本進行追蹤檢測。

綜上所述，病毒核酸檢測應(yīng)用于無償獻血者乙型肝炎病毒篩查，可以提高不合格標(biāo)本的檢出率，有效降HBV經(jīng)輸血傳播的風(fēng)險，進一步保障了臨床輸血的安全性。