李清梅，袁名權(quán)，陳 虎，羅 榮，段顯榮，秦榜勇（遵義醫(yī)學(xué)院麻醉醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003）

肺內(nèi)炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子介導(dǎo)的肺泡毛細(xì)血管膜損傷可導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生，進(jìn)一步發(fā)展可引起急性肺損傷（ALI），其中多形核中性粒細(xì)胞（PMN）在肺內(nèi)的聚集和激活是脂多糖（LPS）所致ALI最常見的病理學(xué)改變和導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制[1]。

FK866（又名 APO866或 WK175）是 2003年由HASMANN等[2]采用美國國家癌癥研究所建立的篩選方法發(fā)現(xiàn)的前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子（PBEF）抑制劑，能特異性非競爭性抑制PBEF。PBEF通過介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，抑制PMN凋亡，調(diào)控肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的通透性，在ALI中起十分重要的作用[3]。MATSUDA等[4]研究數(shù)據(jù)提示，PBEF可能是炎性通路中的信號(hào)傳遞者，其作為炎性細(xì)胞因子，通過激發(fā)其他炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，在ALI的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。而PBEF的特異性非競爭性抑制劑FK866能否通過對(duì)PBEF的抑制作用，減輕肺內(nèi)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，對(duì)ALI產(chǎn)生保護(hù)作用，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究擬通過LPS誘導(dǎo)大鼠ALI模型，觀察給予FK866干預(yù)后對(duì)大鼠ALI的影響，從而探討PBEF在ALI中的相關(guān)作用機(jī)制，同時(shí)為ALI的治療提供新的思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（SPF）級(jí)健康雄性SD大鼠，平均體重（250±30）g。由中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0005。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 LPS（E.Coli 055：B5）Sigma-L2880，F(xiàn)K866，二甲基亞砜（DMSO），戊巴比妥鈉。

1.1.3 藥物配制 （1）LPS：每支 10 mg，加生理鹽水（NS）溶解至20 mL，旋渦振蕩器混勻，藥物水平為0.5 mg/mL，4 ℃冰箱保存，一周內(nèi)用完。（2）FK866：每支5 mg，加DMSO溶解至5 mL，旋渦振蕩器混勻，藥物水平為1 mg/mL，4℃冰箱保存，24 h內(nèi)用完。

1.2 方法 將健康雄性SD大鼠50只隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為NS對(duì)照組NS+NS（A組）、單純給藥組 NS+FK866（B 組）、ALI模型組 LPS+NS（C 組）、藥物干預(yù)組LPS+FK866（D組）及溶媒對(duì)照組LPS+DMSO（E組）。經(jīng)尾靜脈注射LPS 5 mg/kg成功制作大鼠內(nèi)毒素ALI模型。給藥6 h后，5組動(dòng)物均腹腔內(nèi)注射2.5%戊巴比妥鈉1 mL/kg麻醉生效后，開胸取左上肺葉；一部分肺組織10%甲醛液中固定肺組織，脫水、石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅（HE）染色光鏡下觀察其病理變化；另一部分肺組織勻漿后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，進(jìn)行ONE-WAY ANOVA處理，方差齊使用LSD法，方差不齊使用Dunnett′T3法進(jìn)行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大體行為變化 A組大鼠自由活動(dòng)、攝食、飲水、口唇顏色、毛發(fā)、呼吸頻率等無改變。B組大鼠大體行為變化與A組相似。C組大鼠呼吸急促，口唇發(fā)紺，眼半閉，精神萎靡，活動(dòng)力差，毛發(fā)糙亂，刺激不活動(dòng)，未見攝食、飲水，鼻腔內(nèi)偶見粉紅色泡沫痰，聽診肺部聞及大面積啰音，偶見血性尿。D組大鼠呼吸稍促，精神萎靡，刺激可見有少許活動(dòng)，偶而可見飲水，聽診肺部可聞及啰音。E組大鼠大體行為變化與C組相似。

2.2 肺組織病理形態(tài)變化 A、B組大鼠肺組織的結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡壁光滑、肺泡腔及間質(zhì)基本無液體及紅細(xì)胞滲出，肺泡間質(zhì)無增寬及炎性細(xì)胞浸潤，見圖1、2。C、E組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)明顯增寬，肺間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞滲出，肺泡腔見大量滲出液，大量肺泡腔塌陷及肺泡壁斷裂，見圖3、4。D組大鼠肺組織肺間質(zhì)增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤及紅細(xì)胞滲出，肺泡腔見大量滲出液，部分肺泡壁斷裂，局部肺泡腔塌陷，但較C、E組有所減輕，見圖5。

2.3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-β蛋白水平比較 與A、B組比較，其余各組TNF-α及IL-1β水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與 D 組比較，C、E組TNF-α及IL-1β水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組TNF-α及IL-1β水平與B組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組 TNF-α 及 IL-1β 水平與E組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 A組肺組織HE染色（200×）

圖2 B組肺組織HE染色（200×）

圖3 C組肺組織HE染色（200×）

圖4 E組肺組織HE染色（200×）

圖5 D組肺組織HE染色（200×）

表1 各組大鼠肺組織TNF-α及IL-1β蛋白水平比較（±s，ng/L）

表1 各組大鼠肺組織TNF-α及IL-1β蛋白水平比較（±s，ng/L）

注：與 A、B 組比較，aP＜0.05；與 C、E 組比較，bP＜0.05；與 D 組比較，cP＜0.05

組別A組B組C組D組E組n 10 10 10 10 10 TNF-α 148.70±14.75bc 141.87±10.81bc 243.80±9.59ac 214.80±8.23ab 247.69±12.28ac IL-β 19.77±2.67bc 19.95±3.08bc 33.80±3.32ac 26.90±2.65ab 35.16±3.68ac

3 討 論

臨床上，嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等多種情況均可能導(dǎo)致失控性全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），誘發(fā)ALI。其中，嚴(yán)重內(nèi)毒素膿毒癥所致ALI的發(fā)生較為常見。有研究顯示，LPS作為重要的促炎因子，可通過上皮細(xì)胞TOLL樣受體 4（TLR-4）激活NF-κB通路參與炎性反應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)尾靜脈注射LPS成功制作大鼠ALI模型。近期研究發(fā)現(xiàn)，PBEF作為一種新的炎性細(xì)胞因子與ALI病理生理密切相關(guān)。PBEF能促進(jìn)肺泡上皮損傷，增加肺泡通透性[6]。而FK866作為PBEF的特異性抑制劑[4]，能通過非競爭性結(jié)合PBEF，抑制其酶活性，發(fā)揮抗炎性反應(yīng)作用。參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道，F(xiàn)K866的用藥劑量為10 mg/kg，根據(jù)LPS和FK866的用藥劑量，可換算出每只老鼠注射2種藥的容量均為10 mL/kg。

TNF-α是ALI炎性失控機(jī)制中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，被認(rèn)為是全身性炎癥反應(yīng)的始動(dòng)介質(zhì)，也是導(dǎo)致ALI加重的重要因子。其中，TNF-α是啟動(dòng)急性炎性反應(yīng)的主要細(xì)胞因子。有文獻(xiàn)報(bào)道，TNF-α?xí)a(chǎn)生過多可破壞溶酶體，從而導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞損傷[8]。有研究觀察到炎性細(xì)胞因子TNF-α等能夠促進(jìn)PBEF的表達(dá)[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS可誘導(dǎo)小鼠肺組織中IL-6和 TNF-α 水平增多[10]。VAN-GOOL 等[11]研究表明，在許多炎性疾病中，TNF合成受到PBEF影響，PBEF通過Sirtuin家族Sirt6途徑在轉(zhuǎn)錄后水平提高，增加了TNF的合成產(chǎn)量。ESPOSITO等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射FK866可減輕壓縮性脊髓損傷小鼠模型的脊髓炎性反應(yīng)和損傷程度，糾正損傷部位PBEF的高表達(dá)水平，降低病灶周圍TNF-α、IL-1β水平，維護(hù)損傷部位脊髓正常的灰質(zhì)/白質(zhì)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)大鼠ALI后，TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與上述研究報(bào)道結(jié)果相符。應(yīng)用PBEF特異性抑制劑FK866腹腔注射干預(yù)后，肺組織TNF-α水平明顯降低，推測FK866可能通過下調(diào)PBEF的基因轉(zhuǎn)錄，減低PBEF蛋白表達(dá)，從而抑制TNF-α的釋放，對(duì)ALI產(chǎn)生了保護(hù)作用。

IL-1β是具有觸發(fā)進(jìn)一步炎性反應(yīng)的促炎性細(xì)胞因子，可以刺激炎性細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生，因此被稱之為“早期反應(yīng)細(xì)胞因子”[13]。在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生、發(fā)展中，出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其早期外周血、肺及其他組織中的炎性細(xì)胞快速釋放TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子，形成第1次級(jí)聯(lián)釋放，釋放出的細(xì)胞因子作用于肺組織中的肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等激發(fā)趨化因子等引起第2次級(jí)聯(lián)釋放[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎性模型中，PBEF升高伴隨著NF-κB的激活，繼而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8表達(dá)和釋放。而在使用PBEF抑制劑FK866后，NF-κB活性降低，炎性細(xì)胞因子表達(dá)下降[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)大鼠ALI后，肺組織IL-1β的水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與上述研究報(bào)道結(jié)果相符。應(yīng)用PBEF特異性抑制劑FK866腹腔注射干預(yù)后，肺組織IL-1β水平明顯降低，推測FK866可能通過下調(diào)PBEF的基因轉(zhuǎn)錄，減低PBEF的蛋白表達(dá)，從而抑制了促炎性細(xì)胞因子IL-1β的釋放，對(duì)ALI產(chǎn)生了保護(hù)作用。

綜上所述，F(xiàn)K866作為一種PBEF的特異性非競爭性抑制劑，可通過抑制肺組織促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)和釋放，一定程度上減輕LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺組織病理損傷程度，對(duì)內(nèi)毒素ALI大鼠肺組織具有一定的保護(hù)作用。因此，其在臨床膿毒癥致ALI的藥物治療中具有潛在的研究價(jià)值。