◎ 張 波，陸 健

（1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江 杭州 310018；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

“以麥制曲，用曲釀酒”是中國黃酒的特色，也是黃酒釀造過程中的一項(xiàng)傳統(tǒng)工藝[1]。黃酒企業(yè)為適應(yīng)黃酒現(xiàn)代化生產(chǎn)的需要，在20世紀(jì)60年代開始推廣應(yīng)用熟麥曲。熟麥曲就是將小麥蒸熟后，殺死原料中的微生物，接種純種的米曲霉進(jìn)行培養(yǎng)，制曲過程中調(diào)節(jié)溫濕度，供給空氣，促使米曲霉在曲料上生長繁殖并積累代謝產(chǎn)物[2]。熟麥曲制曲時(shí)間短、且淀粉酶、蛋白酶活較高，在黃酒釀造過程中，能加快黃酒發(fā)酵，生產(chǎn)效率高。但由于微生物單一，所釀造黃酒口味寡淡，香氣較差[2-3]。

黃酒麥曲中存在多種蛋白質(zhì)，特別是酶蛋白，是麥曲實(shí)現(xiàn)其功能的重要基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)直接針對(duì)黃酒熟麥曲中酶蛋白的研究開展較少，主要集中在淀粉酶、蛋白酶等，其手段大多為蛋白純化和酶活測定[4-5]。此類方法對(duì)于同工酶的構(gòu)成及其來源等無法獲得，更談不上從整體上獲取麥曲中蛋白質(zhì)組成的信息[4-6]。宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是以一個(gè)細(xì)胞、組織或有機(jī)體中所有蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，從整體來分析蛋白質(zhì)組成及活動(dòng)變化規(guī)律[7]。宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究黃酒麥曲中蛋白質(zhì)組成及功能提供了思路和方法。

宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要包括蛋白質(zhì)的提取和分離，質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫的檢索分析。其中，雙向凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的不同可以有效分析樣品中的復(fù)雜蛋白[7-9]。由于雙向凝膠步驟繁瑣、電泳實(shí)驗(yàn)周期長、干擾因素較多，對(duì)后期蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性有直接影響[5]。因此，對(duì)于黃酒熟麥曲樣品，需摸索出專用的實(shí)驗(yàn)條件，建立一套穩(wěn)定性強(qiáng)、分辨率高和重復(fù)性好的宏蛋白質(zhì)組的樣品制備方法。

1 材料與儀器

①實(shí)驗(yàn)材料。熟麥曲，浙江古越龍山釀酒有限公司提供。②實(shí)驗(yàn)試劑。樣品制備、雙向電泳所用部分試劑見孔令瓊[4]的相關(guān)研究。③實(shí)驗(yàn)儀器。微量高速冷凍離心機(jī)（Pico & Fresco17），Thermo公司生產(chǎn)。等電聚焦電泳儀（Ettan IPGphor 3）、垂直電泳系統(tǒng)（Ettan DALTsix）和掃描儀（ImageScanner）均為GE公司儀器。紫外可見分光光度計(jì)（UV-2100型），UNICO儀器有限公司。

這段歷史讓NIH前院長哈羅德·瓦默斯（Harold Varmus）對(duì)2025年的目標(biāo)持有謹(jǐn)慎態(tài)度。他說：“沒有人否認(rèn)對(duì)阿爾茨海默病的研究亟須取得進(jìn)展，但是我希望不要對(duì)其限定日期?！?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

參照GE公司《雙向電泳操作手冊(cè)》進(jìn)行水化上樣和等電聚焦[5]。

2.2 雙向電泳實(shí)驗(yàn)分析

①麥曲浸提液的制備。稱取10 g熟麥曲，加入25 mL 0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.2），1片復(fù)合酶抑制劑，在4 ℃條件下浸提過夜。②使用4層紗布過濾，粗濾液以12 000 r/min轉(zhuǎn)速，4 ℃條件下離心0.5 h，上清液即為麥曲浸提液。③使用0.22 μm的微孔濾膜過濾麥曲浸提液，過濾兩次，所得濾液進(jìn)行超濾濃縮。④樣品進(jìn)行沉淀處理，去除核酸、脂肪、糖類等雜質(zhì)。⑤蛋白質(zhì)樣品加入合適體積的水化液，充分溶解后，使用RC-DC蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度[4]。

蛋白質(zhì)上樣量的高低直接影響雙向電泳圖譜的質(zhì)量。蛋白質(zhì)上樣量低，導(dǎo)致樣品蛋白無法在電泳圖譜中完全呈現(xiàn)。蛋白質(zhì)上樣量過高，會(huì)導(dǎo)致雙向電泳過載，有條紋的存在，電泳圖譜中蛋白點(diǎn)重合[10]。本實(shí)驗(yàn)中稱取一定量0.1mol/L pH4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液獲得麥曲浸提液，使用Clean Up Kit試劑盒去除浸提液中核酸、脂肪、糖類等雜質(zhì)，使用RC-DC蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度。分別控制上樣量為20μg和90μg熟麥曲浸提蛋白，進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)凝膠染色、脫色，掃描結(jié)果如圖2所示。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同樣品處理方法對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響

分析圖譜1發(fā)現(xiàn)，使用Clean Up Kit試劑盒法相對(duì)丙酮法所獲得圖譜質(zhì)量較好，所獲得蛋白斑點(diǎn)數(shù)目相對(duì)較多，蛋白質(zhì)點(diǎn)較為清晰，而且水平和垂直方向拖尾現(xiàn)象不明顯。而丙酮法所檢測到的蛋白點(diǎn)較少，并且圖譜中有明顯的水平和垂直條紋。所以，使用Clean Up Kit試劑盒能夠去除大量的干擾物質(zhì)，電泳聚焦方面優(yōu)于丙酮法。

圖1 不同樣品處理方法所獲得的雙向電泳圖譜圖

熟麥曲是將小麥碾碎后接種米曲霉純種發(fā)酵而成。使用0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液來浸提麥曲，浸提液中除了可溶性蛋白質(zhì)，還有脂肪、核酸、糖類、鹽離子等干擾物質(zhì)的殘留，嚴(yán)重影響等電聚焦，從而影響雙向電泳結(jié)果。如多糖類物質(zhì)（尤其是帶有電荷類的多糖），往往會(huì)導(dǎo)致雙向電泳圖譜中出現(xiàn)條紋，溶液中鹽離子濃度過高的話，可能導(dǎo)致等電聚焦失敗等[7-8]。因此，除去樣品中雜質(zhì)是非常必要的步驟。本研究采用丙酮法和Clean Up Kit試劑盒兩種不同的樣品處理方法來去除麥曲浸提液中的鹽離子、多糖類等干擾電泳效果的雜質(zhì)，經(jīng)過樣品處理的蛋白經(jīng)過雙向電泳實(shí)驗(yàn)，凝膠染色脫色后圖譜如圖1所示。

3.2 不同上樣量對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響

①膠條水化。吸取125 μL麥曲樣品水化液加入泡脹盤中，放置7 cm、pH 3～10 NL膠條水化過夜（12 h）。②第一向等電聚焦。水化過夜后的膠條用水沖洗干凈后轉(zhuǎn)移到膠條槽中，進(jìn)行等電聚焦。③膠條平衡。等電聚焦結(jié)束后，將膠條用水沖洗干凈后，放置到平衡液中，經(jīng)過兩次平衡，每次平衡15 min。④SDS-PAGE電泳。配制12.5%分離膠，以恒流進(jìn)行電泳，開始時(shí)10 mA，等蛋白完全從膠條中轉(zhuǎn)移到凝膠中后，再以20 mA電泳至溴酚藍(lán)遷移至凝膠最底部，電泳結(jié)束。⑤凝膠染色。電泳結(jié)束后剝離凝膠，置于固定液固定1 h后，換到考馬斯亮藍(lán)染色液中染色4 h，換脫色液中脫色，直至凝膠背景清晰。⑥凝膠掃描。使用Image ScannerIII凝膠成像系統(tǒng)對(duì)染色好的凝膠進(jìn)行掃描并保存圖像。

圖2 不同上樣量的熟麥曲雙向電泳圖譜

由圖2可知，上樣量較低時(shí)，蛋白點(diǎn)聚焦較好，蛋白點(diǎn)數(shù)目較少，只有24個(gè)蛋白點(diǎn)。上樣量90μg左右時(shí)，蛋白點(diǎn)的數(shù)目較多，存在有94個(gè)蛋白點(diǎn)，但有4個(gè)蛋白點(diǎn)豐度較高，幾乎要覆蓋其他蛋白點(diǎn)。絕大部分的蛋白點(diǎn)是分布在酸性端。后期可以考慮使用pH4～7膠條來進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，以獲得更高分辨率的圖譜。

檢索出相關(guān)文獻(xiàn)138篇，剔除重復(fù)發(fā)表的、閱讀摘要及全文，共篩選出16篇RCTs，納入1 745例患者，其中低劑量組900例，標(biāo)準(zhǔn)劑量組845例。文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)8篇為B級(jí)[3,8,13,15,17,18,20,22]，其余均為C級(jí)，納入文獻(xiàn)特征見表1。

高溫高密度泥漿技術(shù)、高壓差堵漏技術(shù)、高溫高強(qiáng)度固壁技術(shù)以及垂鉆技術(shù)(或純機(jī)械式垂鉆系統(tǒng))+取心技術(shù)實(shí)現(xiàn)長裸眼井段鉆進(jìn)；泥漿材料以及高溫孔底儀器和鉆具滿足175℃要求；堵漏和固壁材料滿足250℃要求。

4 結(jié)論

蛋白質(zhì)的提取與分離是宏蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)之一。本研究利用pH4.2醋酸-醋酸鈉緩沖溶液浸提黃酒熟麥曲中所有可溶性蛋白，雙向電泳技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。通過一系列實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響雙向電泳結(jié)果的關(guān)鍵條件進(jìn)行研究，初步建立了適合于紹興黃酒熟麥曲的宏蛋白質(zhì)組的樣品制備方法體系。

2012年1月15日，湖南省汝城縣小型農(nóng)田水利重點(diǎn)縣建設(shè)項(xiàng)目在該縣土橋鎮(zhèn)黃家村正式啟動(dòng)。據(jù)了解，該項(xiàng)目總投資達(dá)到17140萬元，雄厚的資金為汝城的農(nóng)田水利基本建設(shè)注入強(qiáng)勁的發(fā)展動(dòng)力。

影響樣品制備結(jié)果的因素很多，包括實(shí)驗(yàn)材料的選擇、樣品處理的方法、樣品上樣量、等電聚焦程序、試劑的純凈度及操作人員的熟練程度等。其中，樣品處理方法是樣品制備成功的關(guān)鍵程序，樣品處理方法如果選擇不當(dāng)，會(huì)造成浸提液中大量鹽離子和多糖類物質(zhì)殘留，影響雙向電泳結(jié)果。本研究中對(duì)比了丙酮法和Clean Up Kit試劑盒法來處理麥曲浸提液，發(fā)現(xiàn)Clean Up Kit試劑盒法能夠有效去除鹽離子、多糖等干擾物質(zhì)，蛋白點(diǎn)數(shù)目較多且清晰，無拖尾現(xiàn)象。而丙酮法蛋白點(diǎn)較少且存在水平和垂直方向的條紋。因此，樣品處理方法選擇Clean Up Kit試劑盒來去除雜質(zhì)。樣品上樣量也是影響樣品制備的關(guān)鍵因素之一。低上樣量會(huì)導(dǎo)致樣品中蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)不完全，高上樣量會(huì)導(dǎo)致雙向電泳過載，蛋白點(diǎn)重合，有橫縱條紋存在，甚至是拖尾。對(duì)于本研究中使用的長度為7 cm，pH值為3～10非線性的IPG膠條，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的上樣量為90μg時(shí)，分離效果較好。

5 結(jié)語

通過一系列實(shí)驗(yàn)，本研究初步建立了適合紹興黃酒熟麥曲的宏蛋白質(zhì)組的樣品制備方法體系，得到了分辨率較高、重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜，為進(jìn)一步分析熟麥曲中所有可溶性蛋白的組成和來源奠定了基礎(chǔ)。