王 朔，梁 如，馮 曼，王鵬偉，高樹明，李 琳，高 杉，殷 佳，于春泉

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

近年來心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，已成為全球人口死亡的主要原因[1-3]，其致死率約占所有疾病的30%，其中冠心病隨人群年齡增長(zhǎng)而升高，成為世界上發(fā)病率、病死率、致殘率和經(jīng)濟(jì)損失較高的主要疾病。冠心病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痛”、“心痛”、“真心痛”等范疇，為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛多為氣虛、血虛、陰虛和陽(yáng)虛，標(biāo)實(shí)多為氣滯、血瘀、痰濁和寒凝，冠心病中醫(yī)證候臨床流行病學(xué)調(diào)查[4]結(jié)果顯示，最常見的證候大多與痰和瘀相關(guān)，痰瘀互結(jié)證已經(jīng)成為冠心病現(xiàn)代臨床的基本證候之一。

本研究采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠建立冠心病痰瘀互結(jié)證小鼠模型，模型建立后，通過一般狀態(tài)、左心室功能、血脂水平、血管內(nèi)皮因子和病理改變等多方面對(duì)冠心病痰瘀互結(jié)證發(fā)病產(chǎn)生的影響進(jìn)行探討，為開展方證對(duì)應(yīng)關(guān)系研究及中藥作用機(jī)制研究提供可參考的動(dòng)物模型。

1 材料

6周齡SPF級(jí)健康雄性純合子ApoE-/-小鼠40只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為11400700206247，許可證號(hào)為 SCXK（京）2016-0011；6周齡SPF級(jí)健康的雄性C57BL/6J小鼠30只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為11400700206246，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0011。高脂飼料由江蘇美迪森醫(yī)藥有限公司提供，產(chǎn)品貨號(hào)為MD12015。

小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)vevo2100（加拿大）、日本數(shù)碼拍攝系統(tǒng)（Olympus DP71）、美國(guó)Flex Station 3多功能微孔板分析儀（Molecular Devices公司）、異氟烷（河北九派制藥公司）、膽固醇（TC）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）、甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）、低密度脂蛋白（LDL）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）、高密度脂蛋白（HDL）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）、異丙醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）、叔戊醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）、油紅O染液（北京索萊寶科技有限公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于天津市南開醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)期間保持環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%，明暗交替各周期為12 h，分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分組，自由進(jìn)食和飲水。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將40只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分成血瘀組（15只）、痰濁組（10只）和痰瘀互結(jié)組（15只），將30只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成空白組（15只）和假手術(shù)組（15只）。實(shí)驗(yàn)期間痰濁組和痰瘀互結(jié)組喂養(yǎng)高脂飼料12周，其余各組全程給予普通飼料喂養(yǎng)12周。

2.2 模型制備方法 痰濁組：采用高脂飼料喂養(yǎng)12周，期間死亡2只。血瘀組：在8周末行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)，脫去胸前毛發(fā)，使用異氟烷麻醉并進(jìn)行仰臥位固定，碘伏消毒，沿心臟搏動(dòng)最明顯處開胸，暴露心臟，在左心耳和肺動(dòng)脈圓錐之間結(jié)扎，術(shù)后立即將心臟送回胸腔，迅速擠壓關(guān)閉胸腔，縫合創(chuàng)口，使其自行恢復(fù)自主呼吸。剔除死亡小鼠5只，繼續(xù)飼養(yǎng)至12周。痰瘀互結(jié)組：手術(shù)方法同血瘀組，同時(shí)給予高脂飼料喂養(yǎng)，造模過程中死亡6只，后期飼養(yǎng)過程中死亡2只。假手術(shù)組：手術(shù)方法同血瘀組，但只進(jìn)行穿線不結(jié)扎。

2.3 指標(biāo)采集方法

2.3.1 一般狀態(tài)觀察 觀察并記錄小鼠體質(zhì)量變化、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤、厭食情況、二便情況等。

2.3.2 超聲心動(dòng)檢測(cè)小鼠心功能 采用三溴乙醇進(jìn)行腹腔麻醉，脫去胸前毛發(fā)，并固定于操作臺(tái)上，調(diào)節(jié)探頭垂直于小鼠左胸壁，在超聲長(zhǎng)軸切面下，可見心臟沿二尖瓣口至心尖方向的左室長(zhǎng)軸像。主要檢測(cè)指標(biāo)：左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）、左心室短軸收縮率（FS）、左心室質(zhì)量（LV Mass）、流出道血流速度（LVOT）。分別于第8周末行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)后和第12周末進(jìn)行心功能檢測(cè)。

2.3.3 血清血脂水平檢測(cè) 第12周末進(jìn)行摘眼球取血，3 500 r/min，10 min 離心，取血清，檢測(cè) TC、TG、LDL-C、HDL-C。

2.3.4 心臟組織蘇木精-伊紅（HE）染色 將心臟組織置于10%中性緩沖福爾馬林固定24 h，經(jīng)脫水，浸蠟包埋，切片（5μm）烘干后，進(jìn)行HE染色。在顯微鏡下選取合適視野采集并觀察。

2.3.5 主動(dòng)脈組織油紅O染色 沿脊柱完整剝離主動(dòng)脈至雙側(cè)髂總動(dòng)脈，去掉主動(dòng)脈外壁上脂肪和結(jié)締組織，并包于濾紙，放入10%中性福爾馬林固定。將主動(dòng)脈從10%福爾馬林中取出，用蒸餾水漂洗，經(jīng)異丙醇浸洗，油紅O染色，異丙醇分化，直至血管壁透明。選取合適角度采集圖像，對(duì)主動(dòng)脈的脂質(zhì)沉積情況進(jìn)行描述與分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)各數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析法（One-Way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察情況 各組小鼠的體質(zhì)量在第12周均比第0周顯著增加，符合小鼠正常生長(zhǎng)規(guī)律，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）?？瞻捉M、假手術(shù)組和血瘀組小鼠的進(jìn)食量、活動(dòng)度和二便均正常，未出現(xiàn)下肢水腫。痰濁組和痰瘀互結(jié)組由于喂養(yǎng)高脂飼料，從第7周開始進(jìn)食量有所減少，出現(xiàn)一定的厭食癥狀，活動(dòng)度有所減少，痰濁組小鼠體質(zhì)量開始下降，直至第12周明顯降低。痰濁組和痰瘀互結(jié)組均未出現(xiàn)下肢水腫，且二便正常，由于喂養(yǎng)高脂飼料，大便呈綠色，相較于空白組、假手術(shù)組和血瘀組，毛皮更油膩。見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes of the weight in mice

3.2 小鼠心臟超聲檢測(cè)

3.2.1 造模8周對(duì)小鼠心功能的影響 造模8周，行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后，與空白組或假手術(shù)組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結(jié)組EF、FS值均顯著降低（P＜0.01），血瘀組和痰瘀互結(jié)組左心室質(zhì)量顯著增大（P＜0.01或P＜0.05），流出道血流速度顯著降低（P＜0.01）；與血瘀組比較，痰瘀互結(jié)組的 EF、FS 值顯著降低（P＜0.05）；與血瘀組相比，痰瘀互結(jié)組心功能指標(biāo)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 造模8周對(duì)小鼠心功能的影響Tab.1 Effects of eight weeks of molding on cardiac function in mice

表1 造模8周對(duì)小鼠心功能的影響Tab.1 Effects of eight weeks of molding on cardiac function in mice

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與血瘀組比較，△P＜0.05；與痰濁組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

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表2 造模12周對(duì)小鼠心功能的影響Tab.2 Effects of twelve weeks of molding on cardiac function in mice（

表2 造模12周對(duì)小鼠心功能的影響Tab.2 Effects of twelve weeks of molding on cardiac function in mice（

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.2.2 造模12周對(duì)小鼠心功能的影響 造模12周后，與空白組或假手術(shù)組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結(jié)組 EF、FS值顯著降低（P＜0.01或 P＜0.05），左心室質(zhì)量顯著增加（P＜0.01或 P＜0.05），痰瘀互結(jié)組流出道血流速度顯著降低（P＜0.01）。見表2。

3.3 小鼠血脂水平的變化 與空白組或假手術(shù)組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結(jié)組TG、LDL顯著升高（P＜0.01或 P＜0.05），痰瘀互結(jié)組 TC、HDL 顯著升高（P＜0.01）；與血瘀組比較，痰濁組 TG、LDL 顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01），痰瘀互結(jié)組 TC、HDL 顯著升高（P＜0.01）；與痰濁組比較，痰瘀互結(jié)組TC、HDL-C 顯著升高（P＜0.01）。見表 3。

3.4 心臟組織和主動(dòng)脈組織病理變化

3.4.1 主動(dòng)脈竇HE染色 空白組及假手術(shù)組主動(dòng)脈竇內(nèi)膜完整光滑，主動(dòng)脈厚薄均勻，未見脂質(zhì)條紋或纖維斑塊，主動(dòng)脈瓣形態(tài)正常，細(xì)胞排列整齊，瓣膜附著處見正常心肌細(xì)胞。血瘀組主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，管壁厚度不均，部分管壁向管腔內(nèi)突出，外膜可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫，部分瓣膜上有纖維斑塊形成。痰濁組主動(dòng)脈內(nèi)膜顯著增厚、廣泛纖維化，內(nèi)膜下有大量脂質(zhì)沉淀，可見大面積的粥樣斑塊，斑塊中有大量泡沫細(xì)胞和粥樣斑塊病灶，外膜出現(xiàn)明顯的炎細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)。痰瘀互結(jié)組主動(dòng)脈內(nèi)膜顯著增厚，主動(dòng)脈壁厚薄程度不均勻，主動(dòng)脈瓣變形、增厚，可見成熟的粥樣斑塊，管腔顯著狹窄，瓣膜附著處出現(xiàn)大面積的粥樣斑塊，有大量泡沫細(xì)胞，斑塊中大量脂質(zhì)融合成片，可見大片粥樣壞死核和大量梭狀膽固醇結(jié)晶，外膜出現(xiàn)明顯的炎細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

與空白組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結(jié)組斑塊面積和斑塊占管腔面積的百分比均明顯升高（P＜0.01），與假手術(shù)組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結(jié)組的斑塊面積顯著增大，斑塊占管腔面積百分比均顯著升高（P＜0.01），與血瘀組相比，痰濁組斑塊面積增大（P＜0.01），痰瘀互結(jié)組的斑塊面積和斑塊占管腔面積比值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

3.4.2 主動(dòng)脈組織病理變化 經(jīng)油紅O染色后，空白組和假手術(shù)組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑平整，可見少量紅色點(diǎn)狀脂斑散在分布。血瘀組紅色塊狀脂斑分布于整個(gè)主動(dòng)脈，且斑塊主要集中在主動(dòng)脈弓分叉處及主動(dòng)脈中部，主動(dòng)脈弓部斑塊最集中，呈塊狀分布，病變處的動(dòng)脈壁增厚。痰濁組主動(dòng)脈內(nèi)膜上有較多斑塊，較集中于主動(dòng)脈弓部及腹主動(dòng)脈以下的部位，腹主動(dòng)脈部位可見大片紅色塊狀脂斑，面積較大，斑塊沉積部位管壁明顯增厚。痰瘀互結(jié)組主動(dòng)脈紅色斑塊主要集中分布在主動(dòng)脈弓部及腹主動(dòng)脈以下的部位，病變部位管壁顯著增厚，主動(dòng)脈弓部可見大量斑塊集中分布，面積較大，腹主動(dòng)脈區(qū)域也可見較多塊狀斑塊。見圖3。

與空白組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結(jié)組主動(dòng)脈內(nèi)膜的斑塊面積顯著增大（P＜0.01），與假手術(shù)組相比，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結(jié)組主動(dòng)脈內(nèi)壁上斑塊的面積顯著增大（P＜0.01），與血瘀組比較，痰瘀互結(jié)組主動(dòng)脈所沉積的斑塊面積顯著增大（P＜0.05）。見表 5。

表3 小鼠血脂水平的變化（Tab.3 The change of lipid levels in mice（mmol/L

表3 小鼠血脂水平的變化（Tab.3 The change of lipid levels in mice（mmol/L

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與血瘀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與痰濁組比較，▲▲P＜0.01。

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圖2 主動(dòng)脈竇病理變化結(jié)果（×100）Fig.2 Results of pathological changes of aortic sinus（×100）

4 討論

冠心病有動(dòng)脈粥樣硬化與心肌缺血的雙重病理特征，中醫(yī)將動(dòng)脈粥樣硬化與血脂的升高作為“痰”的表現(xiàn)，將心肌缺血和血液流變學(xué)的變化作為“瘀”的表現(xiàn)，故冠心病易表現(xiàn)出痰瘀等病理癥狀[5]。冠心病是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)的，而脂質(zhì)代謝異常則是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因，研究結(jié)果顯示，因脂質(zhì)代謝異常引起的高脂血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素，為冠心病的啟動(dòng)因子和促進(jìn)因子[6]，同時(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化的形成、發(fā)展和斑塊的破裂是冠心病發(fā)展的病理基礎(chǔ)，因此，血脂代謝紊亂，痰阻血脈可看作冠心病的誘因，為血液流變方面的異常變化，瘀血阻礙氣機(jī)，可看作冠心病的促進(jìn)因素，痰瘀兩者相互搏結(jié)、互為因果，影響津液的運(yùn)化，形成痰瘀相隨、痰瘀病損的發(fā)展過程，最終引發(fā)冠心病。這也從脂質(zhì)代謝的角度對(duì)中醫(yī)理論中“痰”和“瘀”的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)歸進(jìn)行了解釋[7-8]。

ApoE是血漿中一種重要的載脂蛋白[9]，主要通過調(diào)節(jié)CM殘粒受體及LDL受體的配體功能發(fā)揮作用，影響機(jī)體脂代謝功能及膽固醇平衡，因此與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。ApoE-/-小鼠是公認(rèn)的研究AS發(fā)病機(jī)制較理想的動(dòng)物模型[10]，由于缺乏ApoE基因，殘粒代謝速度加快，導(dǎo)致LDL合成增加，LDL受體下降，分解降低，使LDL代謝障礙，表現(xiàn)為血脂水平明顯異常，脂質(zhì)沉積于血管壁，容易形成AS病灶，因此更容易形成是冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化，故本研究采用ApoE-/-小鼠作為冠心病痰瘀互結(jié)證的研究對(duì)象[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎聯(lián)合喂養(yǎng)高脂飼料ApoE-/-小鼠建立冠心病痰瘀互結(jié)證小鼠模型，通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，造成冠心病中心肌缺血的病理特征，以模擬冠心病痰瘀互結(jié)證中“瘀”[12]的癥狀，通過喂養(yǎng)高脂飼料，使ApoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝紊亂，形成冠心病中動(dòng)脈粥樣硬化的病理特點(diǎn)，以模擬冠心病痰瘀互結(jié)證中“痰”[13]的特征。研究結(jié)果表明，相較于假手術(shù)組，痰瘀互結(jié)組的心功能明顯損傷，符合冠心病痰瘀互結(jié)證“瘀”的病理癥狀；相較與假手術(shù)組，痰瘀互結(jié)組血清中血脂水平異常，主動(dòng)脈竇處有明顯的粥樣斑塊，主動(dòng)脈管腔顯著狹窄，主動(dòng)脈大體油紅O染色斑塊面積顯著，具有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化的特點(diǎn)，符合冠心病痰瘀互結(jié)證“痰”的病理特征。綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)通過冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠成功建立冠心病痰瘀互結(jié)證小鼠模型。

表4 主動(dòng)脈竇斑塊面積以及管腔狹窄程度結(jié)果（Tab.4 Results of aortic sinusplaque area and degree of stenosis

表4 主動(dòng)脈竇斑塊面積以及管腔狹窄程度結(jié)果（Tab.4 Results of aortic sinusplaque area and degree of stenosis

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術(shù)組比較，**P＜0.01，與血瘀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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圖3 主動(dòng)脈油紅O染色結(jié)果Fig.3 Aortic oil red O staining results

表5 主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積結(jié)果Tab.5 Results of aortic intimal plaqueareaμm2

表5 主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積結(jié)果Tab.5 Results of aortic intimal plaqueareaμm2

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與血瘀組比較，△P＜0.05。

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