劉艷 古麗比克·木拉提 瑪力亞木·阿布力提甫 易星 李君蓮 師永歡 劉天劍

結(jié)核病是全球重大傳染病之一，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。而耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的產(chǎn)生，使結(jié)核病防治形勢(shì)更加嚴(yán)峻[2]。MDR-TB即至少同時(shí)對(duì)異煙肼(INH)和利福平(RFP)產(chǎn)生耐藥的結(jié)核病[3]，其治療成本高、周期長(zhǎng)、治愈率低，早診斷、早治療是實(shí)現(xiàn)耐藥結(jié)核病有效防控的關(guān)鍵所在[4-6]。目前，常用的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)普遍存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一等缺點(diǎn)；因此，無論臨床還是疾控領(lǐng)域都迫切需要一種快速而準(zhǔn)確的結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)方法[4-8]。本研究應(yīng)用探針熒光PCR熔解曲線法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌DNA鑒定和INH、RFP耐藥突變的快速檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的BACTEC MGIT 960(簡(jiǎn)稱“MGIT 960”)液體培養(yǎng)和液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比較，以評(píng)價(jià)該方法在快速診斷結(jié)核病和MDR-TB中的應(yīng)用價(jià)值，并為相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

一、 標(biāo)本來源

收集2015年9月至2016年12月新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院976例疑似結(jié)核病住院患者的痰液標(biāo)本。

二、 試劑與儀器

RFP、INH購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司； MGIT 960液體培養(yǎng)設(shè)備及培養(yǎng)管購(gòu)于美國(guó)BD公司；4% NaOH由購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)的分析純氫氧化鈉粉末以雙蒸水自行配制；Lab-Aid 824全自動(dòng)核酸提取儀及配套結(jié)核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑購(gòu)于廈門致善生物科技股份有限公司；Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀購(gòu)于美國(guó)伯樂公司。

三、 液體培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)

按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行MGIT 960液體培養(yǎng)(以下簡(jiǎn)稱：液體培養(yǎng))。用移液槍吸取2～5 ml痰液至50 ml離心管中，加入1～2倍體積的4% NaOH溶液，振蕩15～30 s，直至痰標(biāo)本充分液化；隨后加入磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)至離心管45 ml標(biāo)記處，顛倒離心管，充分混勻， 在8～10 ℃條件下， 3000×g離心15 min，棄去上清，加入無菌磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)至終體積為2.5 ml，重懸沉淀，吸取0.5 ml懸浮液于BBL MGIT 960培養(yǎng)管中，擰緊管蓋并充分混勻；最后將MGIT 960培養(yǎng)管放入儀器內(nèi)進(jìn)行孵育， MGIT 960熒光強(qiáng)度記憶探測(cè)器每隔60 min連續(xù)測(cè)定培養(yǎng)管內(nèi)的熒光強(qiáng)度，判斷管內(nèi)分枝桿菌的生長(zhǎng)情況。若出現(xiàn)陽(yáng)性標(biāo)本，儀器紅色指示燈立即閃亮，同時(shí)有報(bào)警提示音。按儀器操作步驟取出陽(yáng)性培養(yǎng)管并自動(dòng)打印出結(jié)果。

培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性者將其培養(yǎng)物采用MGIT 960進(jìn)行 RFP、INH液體藥敏試驗(yàn)。在MGIT 960系統(tǒng)報(bào)告陽(yáng)性之后的5 d之內(nèi)必須完成藥敏試驗(yàn)接種，先將3管BBL MGIT 960培養(yǎng)管分別標(biāo)記為RFP、INH和GC(空白對(duì)照)，并加入0.8 ml配套的增菌劑；將100 μl RFP(83 μg/ml)或INH(8.3 μg/ml)加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)管中，取0.1 ml菌懸液用滅菌生理鹽水按照1∶100進(jìn)行稀釋，吸取0.5 ml于GC培養(yǎng)管中，同時(shí)吸取0.5 ml未稀釋的菌懸液于RFP和INH培養(yǎng)管中，蓋緊管蓋，上下顛倒3～4次，將培養(yǎng)管放入MGIT 960培養(yǎng)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)分枝桿菌的生長(zhǎng)情況對(duì)比而判斷該藥物的敏感性。

四、 熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)RFP、INH耐藥突變

采用結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒和結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群rpoB基因507～533共27個(gè)氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)(81 bp，利福平耐藥決定區(qū))的突變情況；異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ahpC啟動(dòng)子(-44至-30及-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17至-8位點(diǎn))，以及katG315密碼子的突變情況，以進(jìn)行耐藥篩選。

樣本處理及提?。禾狄簶颖綝NA提取前需進(jìn)行液化，將痰液標(biāo)本加到50 ml帶螺旋蓋子的試管中，加入2倍體積的4% NaOH溶液，擰緊螺旋蓋并振蕩混勻30 s，然后室溫放置15 min，期間震蕩數(shù)次，以保證痰液能完全液化。液化后采用Lab-Aid 824結(jié)核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑進(jìn)行提取。

PCR反應(yīng)程序設(shè)置：(1)利福平程序。 UNG酶處理：50 ℃，2 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；降落PCR循環(huán)：95 ℃ 15 s，70 ℃ 20 s(每個(gè)循環(huán)下降1 ℃)，76 ℃ 25 s，13個(gè)循環(huán)； PCR循環(huán)：95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25 s，42個(gè)循環(huán)；熔解分析： 95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，45～85 ℃(設(shè)置在此階段每1 ℃采集FAM 和TET 通道熒光信號(hào))，1個(gè)循環(huán)。(2)異煙肼程序。UNG處理：50 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；降落PCR循環(huán)：95 ℃ 10 s，71 ℃ 25 s(每個(gè)循環(huán)下降1 ℃)，75 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)； PCR循環(huán)： 95 ℃ 10 s，61 ℃ 25 s，75 ℃ 25 s，45個(gè)循環(huán)；熔解分析： 95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，40～80 ℃(設(shè)置在此階段每1 ℃采集FAM 和TET 通道熒光信號(hào))，1個(gè)循環(huán)。

每個(gè)標(biāo)本有2個(gè)反應(yīng)管，同時(shí)檢測(cè) FAM和TET熒光通道信號(hào)。根據(jù)說明書進(jìn)行結(jié)果判讀：當(dāng)標(biāo)本在4個(gè)熒光通道的熔解溫度(Tm值)均與陽(yáng)性對(duì)照的Tm值一致(誤差不超過 ±1 ℃) 時(shí)判定為野生型，此時(shí)對(duì)利福平或異煙肼敏感； 當(dāng)4 個(gè)通道任一通道中標(biāo)本的Tm值低于陽(yáng)性對(duì)照 2 ℃及以上時(shí)(△Tm≥ 2 ℃) 判定為突變型，此時(shí)該樣本對(duì)利福平或異煙肼耐藥。

五、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果間的比較采用敏感度、特異度、符合率、Kappa值(較差：0.00～0.40；中等：0.41～0.60；較高：0.61～0.80；極好：0.81～1.00)等表示，以評(píng)價(jià)熒光PCR熔解曲線法的診斷應(yīng)用價(jià)值。

結(jié) 果

一、診斷效能比較

本研究共收集痰標(biāo)本976份，熒光PCR熔解曲線法對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA鑒定結(jié)果顯示有184份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，792份標(biāo)本為陰性。MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果顯示169份標(biāo)本為陽(yáng)性，807份標(biāo)本為陰性；采用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)進(jìn)行菌種鑒定，液體培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本中有11例為NTM，因此，最終確認(rèn)為培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本為158例，陰性樣本有818例。兩種檢測(cè)方法共同檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)本有135份，共同檢測(cè)為陰性的標(biāo)本為792份。以液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度為85.44%，特異度為94.01%，Kappa值為0.75，符合率為92.62%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為73.37%，陰性預(yù)測(cè)值為97.10%，具體見表1。

二、異煙肼耐藥檢測(cè)結(jié)果

熒光PCR熔解曲線法和液體培養(yǎng)法均檢測(cè)為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性的135份標(biāo)本中，經(jīng)MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有24份標(biāo)本對(duì)異煙肼耐藥，熒光PCR熔解曲線法耐藥突變檢測(cè)結(jié)果顯示26份標(biāo)本對(duì)異煙肼耐藥。以MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)異煙肼是否耐藥的敏感度為83.33%，特異度為94.59%，符合率為92.59%，Kappa值為0.76，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為76.92%，陰性預(yù)測(cè)值為96.33%，具體見表2。

三、利福平耐藥檢測(cè)結(jié)果

熒光PCR熔解曲線法和液體培養(yǎng)法共同檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性的135份標(biāo)本中，經(jīng)MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有24份標(biāo)本對(duì)利福平耐藥，熒光PCR熔解曲線法耐藥突變檢測(cè)結(jié)果顯示28份標(biāo)本對(duì)利福平耐藥。以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為95.83%，特異度為95.50%，符合率為95.56%，Kappa值為0.86，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為82.14%，陰性預(yù)測(cè)值為99.07%，具體見表3。

表1 976份痰標(biāo)本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果

注敏感度=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))=(a+d)/(a+b+c+d)；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=d/(c+d)×100%

表2 135份痰標(biāo)本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗(yàn)異煙肼耐藥檢測(cè)結(jié)果

注敏感度=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))=(a+d)/(a+b+c+d)；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=d/(c+d)×100%

表3 135份痰標(biāo)本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗(yàn)利福平耐藥檢測(cè)結(jié)果

注敏感度=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))=(a+d)/(a+b+c+d)；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=d/(c+d)×100%

討 論

據(jù)WHO報(bào)道，我國(guó)是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[3]，由于人口流動(dòng)性增大和艾滋病流行趨勢(shì)的上升，其防治形勢(shì)更加嚴(yán)峻。而目前傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷和耐藥檢測(cè)方法已經(jīng)無法滿足耐藥結(jié)核病早發(fā)現(xiàn)、早治療的迫切需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生結(jié)核分枝桿菌耐藥的分子機(jī)制與基因突變有關(guān)，不同的基因突變使得結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生不同的藥物耐受性[9]。目前分子水平上的診斷方法主要有線性探針反向雜交法、基因芯片法、實(shí)時(shí)熒光PCR法和熒光PCR熔解曲線法等，為輔助診斷起到積極的促進(jìn)作用[7,10-12]。熒光PCR熔解曲線法將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和熒光探針熔解曲線分析法相結(jié)合，具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼相關(guān)耐藥突變基因進(jìn)行快速檢測(cè)，特別適用于臨床上大批量樣本篩查。

本研究顯示，與MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果相比，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度及特異度較好，熒光PCR熔解曲線法總體檢出的陽(yáng)性率較高。一方面可能因?yàn)镸GIT 960液體培養(yǎng)時(shí)僅限于檢測(cè)標(biāo)本中的活菌；而熒光PCR熔解曲線法因檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA，因此，即使結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)死亡，也可獲得陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。另一方面也可能與實(shí)驗(yàn)人員的操作規(guī)范性、交叉污染等問題有關(guān)[13-14]。不同研究顯示，采用分子生物方法對(duì)痰液中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)于培養(yǎng)法其特異度多數(shù)為90%以上，敏感度為66.4%～100%，多數(shù)在90%左右[15-18]。與本次研究相近，細(xì)微的差別可能與入組的樣本、培養(yǎng)方法、樣本數(shù)量等因素有關(guān)。

在對(duì)異煙肼的耐藥突變檢測(cè)結(jié)果中顯示，熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗(yàn)相比，特異度達(dá)到94%以上，敏感度為83.33%，相比特異度略低，可能與試劑盒尚無法覆蓋所有耐藥突變位點(diǎn)以及少量存在的低水平異質(zhì)性耐藥有關(guān)[7，19]。熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)利福平耐藥突變的敏感度和特異度與MGIT 960藥敏試驗(yàn)相比具有較高的一致性，均達(dá)到95%以上。張國(guó)欽等[20]及黃玉平等[21]分別采用線性探針技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行耐藥檢測(cè)研究，其中對(duì)異煙肼耐藥檢測(cè)的敏感度分別為68.7%和80.4%，低于本次研究?？赡芘c熒光PCR熔解曲線法多覆蓋的ahpC啟動(dòng)子區(qū)有關(guān)。有研究顯示，增加對(duì)ahpC啟動(dòng)子區(qū)的檢測(cè)，可將異煙肼耐藥的檢測(cè)敏感度提高8.5%[7]。馬曉光等[22]應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法對(duì)408例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行異煙肼耐藥檢測(cè)，與藥敏試驗(yàn)相比，特異度和敏感度分別為95.32%和87.69%，與本研究相近。而馬艷艷等[23]則應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法對(duì)347例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行利福平耐藥檢測(cè)，與藥敏試驗(yàn)相比，特異度和敏感度分別為97.42%和93.42%，也與本研究結(jié)果相近。不同之處在于，馬曉光等[22]和馬艷艷等[23]的樣本類型均為結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，而本研究采用的是痰液樣本。此外，上述兩項(xiàng)研究的對(duì)照方法均為比例法固體藥敏試驗(yàn)，而本研究采用的是MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)?？梢?，對(duì)于不同的樣本類型以及不同的藥敏試驗(yàn)對(duì)照方法，熒光PCR熔解曲線法均可獲得良好的檢測(cè)效果。此外，對(duì)于熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為耐藥，而藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感的情況，一方面可能由于操作失誤導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果；另一方面可能與耐藥突變類型有關(guān)，部分突變類型(如rpoB533位點(diǎn)突變)所導(dǎo)致的耐藥水平處于臨界狀態(tài)或者僅導(dǎo)致低水平耐藥[24]，可造成檢測(cè)結(jié)果與藥敏試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)差異。

目前，已有很多研究表明探針熔解曲線熒光PCR熔解曲線法可用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的快速檢測(cè)[10-13]。本次研究也獲得了與傳統(tǒng)方法較為一致的結(jié)果，提示熒光PCR熔解曲線法適用于對(duì)利福平和異煙肼進(jìn)行快速耐藥篩查，以輔助臨床診斷。在臨床應(yīng)用過程中，該方法對(duì)加入反應(yīng)體系的DNA模板質(zhì)量要求較高，若采用常規(guī)水煮法對(duì)痰樣本進(jìn)行DNA提取，可能會(huì)因?yàn)槟０寮兌鹊蛯?dǎo)致熔點(diǎn)偏移或擴(kuò)增抑制，因此，建議采用磁珠法或其他可獲得高質(zhì)量模板的提取方法來提取痰樣本。此外，該試劑盒目前僅采用雙色熒光對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)應(yīng)每個(gè)樣本需要2個(gè)反應(yīng)管來實(shí)現(xiàn)耐藥檢測(cè)，若可以充分利用目前主流實(shí)時(shí)PCR儀的四個(gè)熒光通道，采用四色熒光標(biāo)記，則能使反應(yīng)管數(shù)減半，進(jìn)而提高樣本檢測(cè)通量。后續(xù)可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，確定耐藥突變位點(diǎn)是否有明顯的地域差異以及不同的突變位點(diǎn)的菌株耐藥水平的高低，以期為結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的診治提供參考依據(jù)。