湖北江漢油田總醫(yī)院超聲科(湖北 潛江 433100)

丁 波 李秀蘭 肖 艷許 麗 孫文兵 袁 麗

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，乳腺癌中99%發(fā)生在女性，男性僅占1%[1-2]。乳腺雖然并非參與人體生命活動(dòng)的重要器官，乳腺癌本身不會危及患者生命，但是乳腺周圍卻有許多血管以及淋巴管，一旦癌細(xì)胞脫落，進(jìn)入靜脈或者淋巴管，很有可能發(fā)生轉(zhuǎn)移。部分癌細(xì)胞脫落后甚至可能在血管中形成癌栓，造成多處血栓栓塞，危及生命。有研究[3-4]表明，自21世紀(jì)以來，乳腺癌的發(fā)病率以及死亡率呈逐漸下降，這可能與我國大規(guī)模普查，早期發(fā)現(xiàn)疾病，將其控制于癌前病變有關(guān)。但與發(fā)達(dá)國家相比，我國乳腺癌檢出率仍然處于較低水平，許多乳腺癌患者僅僅在出現(xiàn)癥狀或者乳腺癌晚期的時(shí)候才進(jìn)行體檢而發(fā)現(xiàn)。此時(shí)，乳腺癌治療往往達(dá)不到滿意的效果。因此，全面開展普查，并引進(jìn)先進(jìn)的檢查技術(shù)，能有效發(fā)現(xiàn)早期病變，降低乳腺癌發(fā)病率。目前，臨床常用的普查方法為鉬靶射片，但此方法對于早期的乳腺病變敏感度較低，仍有待改進(jìn)。有報(bào)道[5-6]指出，超聲微血管造影能有效發(fā)現(xiàn)乳腺癌早期血管增生情況，降低漏診情況。為此，我院對120名患者進(jìn)行研究，現(xiàn)將報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院自2012年12月～2014年12月收治的乳腺單純增生婦女20例，非典型增生患者25例，導(dǎo)管內(nèi)原位癌患者30例以及浸潤性導(dǎo)管癌患者20例，同時(shí)征集25名乳腺正常的志愿者。按照乳腺組織病例分型分為正常組、單純增生組、非典型增生組、導(dǎo)管內(nèi)原位癌組、浸潤性導(dǎo)管癌組。其中正常組患者年齡在25～68歲之間，平均年齡為(42±17)歲，已婚女性20名，未婚女性5名；乳腺單純增生組患者年齡在26～67歲之間，平均年齡為(44±17)歲，病程在2～8年之間，平均病程為(3.6±4.4)年，已婚女性15名，未婚女性5名；非典型增生患者年齡在27～68歲之間，平均年齡為(43±16)歲，病程在2～6年之間，平均病程為(3.7±4.4)年，已婚女性21名，未婚女性4名；導(dǎo)管內(nèi)原位癌患者年齡在26～68歲之間，平均年齡為(45±18)歲，病程在2～7年之間，平均病程為(3.4±4.2)年，已婚女性22名，未婚女性8名；浸潤性導(dǎo)管癌組患者年齡在25～69歲之間，平均年齡為(42±17)歲，病程在2～8年之間，平均病程為(3.8±4.9)年，已婚女性14名，未婚女性6名。參與本研究女性均避開月經(jīng)期，與月經(jīng)后1周進(jìn)行試驗(yàn)。以上各組患者性別、年齡、病程等均無明顯差異(P＞0.05)，具有可比性?；颊呒凹覍僦椴⑼獗敬窝芯俊?/p>

1.2 方法采用超聲造影以及免疫組化技術(shù)測定各組患者血管密度(MVD)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、受體Flk-1/KDR的表達(dá)情況。具體方法：超聲檢查選用iU22超聲檢查儀(購自飛利浦公司)，探頭選用L9-3寬頻線陣探頭配合脈沖反相諧波造影，機(jī)械指數(shù)調(diào)整為0.07。模式選用乳腺常規(guī)檢查，彩色多普勒血流成像多切面觀察之后靜脈彈丸式注射提前準(zhǔn)備的白蛋白包裹全氟丙烷全氟顯造影劑0.02ml/kg，造影劑注射后3min開始同步存貯連續(xù)動(dòng)態(tài)圖像。此時(shí)，開啟QLAB分析軟件，實(shí)時(shí)觀察造影劑微泡在血管床中的顯像軌跡。于血流顯像最豐富的部位取樣3次，獲得該區(qū)域血流灌注時(shí)間。強(qiáng)度曲線，觀察并記錄：峰值強(qiáng)度、曲線下面積、廓清時(shí)間等參數(shù)。免疫組化染色：小鼠抗人CD34單克隆抗體、小鼠抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人FLK-1/KDR多克隆抗體按SP試劑盒說明書操作。

1.3 觀察指標(biāo)以及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判斷：以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)。微血管密度測定：參照Weidner[7]方法選取具有代表性的組織切片，排除腫瘤出血區(qū)及邊緣反應(yīng)區(qū)，低倍(10×10)觀察每例切片中3個(gè)血管密度最高區(qū)域即所謂血管熱點(diǎn)區(qū)(hotspot)，高倍鏡(40×10)下計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的MVD，其平均值即作為MVD值。VEGF和Flk-1/KDR表達(dá)測定：采用半定量積分法判定結(jié)果[8]：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；無特異性染色為0分，染色強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(±s)表示，符合正態(tài)分布的采用F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者灌注下造影參數(shù)比較各組患者峰值強(qiáng)度分別為(3 9±1 0)、(38±12)、(74±87)、(6±12)、(121±12db)，由于方差不齊，經(jīng)過非參數(shù)秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組之間峰值強(qiáng)度差異極其明顯(Welch=200.334，P＜0.001)，且各組之間經(jīng)兩兩比較，發(fā)現(xiàn)除了正常組、單純增生組以及導(dǎo)管內(nèi)原位癌組、非典型增生組之間無明顯差異(P＞0.05)，其余兩組之間均差異顯著(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，各組患者曲線下面積以及廓清時(shí)間經(jīng)過Welch檢驗(yàn)，差異明顯(Welch=412.056；Welch=528.189，P＜0.001)，且發(fā)現(xiàn)除了正常組、單純增生組以及導(dǎo)管內(nèi)原位癌組、非典型增生組之間無明顯差異(P＞0.05)，其余兩組之間均差異顯著(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1

2.2 各組患者超聲造影血流動(dòng)力學(xué)與VEGF、Flk -1/KDR對比各組患者M(jìn)VD值分別為(18±5)、(20±5)、(30±4)、(31±8)、(53±4)，經(jīng)過Welch檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組患者M(jìn)VD差異顯著(Welch=368.124，P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且各組之間經(jīng)兩兩比較，發(fā)現(xiàn)除了正常組、單純增生組以及導(dǎo)管內(nèi)原位癌組、非典型增生組之間無明顯差異(P＞0.05)，其余兩組之間均差異顯著(P＜0.05)。同時(shí)，隨著患者病情的逐漸加重，患者乳腺M(fèi)VD也不斷升高。此外，各組患者VEGF、Flk-1/KDR值從正常組到浸潤性導(dǎo)管癌組不斷升高，經(jīng)過F檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組患者VEGF、Flk-1/KDR差異顯著(F=26.41，F(xiàn)=23.65，P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組之間經(jīng)兩兩t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除了正常組、單純增生組以及導(dǎo)管內(nèi)原位癌組、非典型增生組之間無明顯差異(P＞0.05)，其余兩組之間均差異顯著(P＜0.05)。見表2。

2.3 不同MVD值患者的VEGF、Flk-1/KDR值比較由圖一可知隨著各組患者M(jìn)VD值的升高，VEGF、Flk-1/KDR值也不斷增大，MVD的升高可在一定程度上反映VEGF、Flk-1/KDR的變化趨勢。

3 討 論

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤[9]，雖然乳腺癌惡性程度不如其他惡性腫瘤，手術(shù)多能切除，且預(yù)后較好，但乳腺作為女性的重要性征，乳腺癌術(shù)后，患者的心理健康恢復(fù)也是一個(gè)難點(diǎn)。隨著人們對于女性健康的逐漸重視以及對于乳腺疾病認(rèn)識的深入，人們對于乳腺疾病已經(jīng)不在僅僅停留在乳腺疾病的治療上，更多的女性逐漸接受早預(yù)防早治療的觀點(diǎn)。而對乳腺癌癌前疾病的診斷，能有效阻止癌前病變發(fā)展為乳腺癌[10-11]。目前，臨床診斷方法主要有觸診、X線片(包括鉬靶照相)、磁共振、活檢等。但以上方法仍有不足之處。為此，近年來對于乳腺癌診斷方法的研究[12-13]不斷深入，甚至進(jìn)入到了分子生物學(xué)領(lǐng)域。腫瘤的發(fā)生發(fā)展主要有癌前病變、原位癌、浸潤癌、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處播散等階段。癌癥的發(fā)生發(fā)展有其獨(dú)特的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，正常細(xì)胞癌變后某些基因的表達(dá)出現(xiàn)異常，比如細(xì)胞間粘附蛋白的缺失使得癌細(xì)胞不受束縛，是其擴(kuò)散的基礎(chǔ)；而解除抑制效應(yīng)的解除，使其能無限增值，從大體來看就是畸形。而腫瘤的生長最重要的基礎(chǔ)就是血運(yùn)，腫瘤在生長過程中血運(yùn)異常豐富，這使得腫瘤能不斷吸收來自機(jī)體的營養(yǎng)，從而不斷生長。然而，新生血管的不斷增加，勢必導(dǎo)致相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)，比如：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子以及Flk-1/KDR。對于這些生長因子的測定雖然可以為乳腺癌的診斷做出一定的參考，但是價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，不利于普及。并且其無法確定腫瘤的部位，只能說明機(jī)體的血管處于增殖狀態(tài)。超聲作為影響學(xué)檢查的一種重要方法，雖然在臨床開展時(shí)間不長，但近年來發(fā)展迅速，超聲已經(jīng)成為臨床必不可少的診斷工具[14]。超聲造影是利用造影劑使后散射回聲增強(qiáng)，明顯提高超聲診斷的分辨力、敏感性和特異性的技術(shù)。隨著設(shè)備的升級，目前，超聲造影已經(jīng)可以反映和觀察正常組織和病變組織的血流灌注情況，該方法不僅無創(chuàng)而且簡單快速，如果能在此方面有所進(jìn)展，乳腺癌的診斷必定得到重大突破。為此，我院對120名患者進(jìn)行研究，并取得了一定的成果。

表1 各組患者灌注下造影參數(shù)比較（±s）

表1 各組患者灌注下造影參數(shù)比較（±s）

組別 例數(shù) 峰值強(qiáng)度（db） 曲線下面積（dB.s） 廓清時(shí)間（s）正常組 25 39±10 364±29 31.2±4.5單純增生組 20 38±12 375±79 32.5±4.3非典型增生組 25 74±8 682±65 50.7±2.5導(dǎo)管內(nèi)原位癌組 30 76±12 698±107 52.7±5.2浸潤性導(dǎo)管癌組 20 121±12 1302±126 74.7±3.3 F/Welch值 200.334 412.056 528.189 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表2 各組患者超聲造影血流動(dòng)力學(xué)與VEGF、Flk-1/KDR對比（±s）

表2 各組患者超聲造影血流動(dòng)力學(xué)與VEGF、Flk-1/KDR對比（±s）

組別 例數(shù) MVD VEGF（分） Flk-1/KDR（分）正常組 25 18±5 1.2±0.9 1.2±0.7單純增生組 20 20±5 1.3±0.9 1.1±0.7非典型增生組 25 30±4 3.5±1.8 3.3±1.8導(dǎo)管內(nèi)原位癌組 30 31±8 5.8±1.6 5.4±1.5浸潤性導(dǎo)管癌組 20 53±4 7.8±2.6 7.5±2.4 F/Welch值 368.124 26.41 23.65 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 不同MVD值患者的VEGF、Flk-1/KDR值比較。

根據(jù)以上表1結(jié)果顯示，各組患者峰值強(qiáng)度、曲線下面積以及廓清時(shí)間經(jīng)過非參數(shù)秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組之間差異極其明顯(Welch=200.334 W e l c h=4 1 2.0 5 6；W e l c h=528.189，P＜0.001)，且各組之間經(jīng)兩兩比較，發(fā)現(xiàn)除了正常組、單純增生組以及導(dǎo)管內(nèi)原位癌組、非典型增生組之間無明顯差異(P＞0.05)，其余兩組之間均差異顯著(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果表明，不同程度乳腺癌患者之間超聲造影結(jié)果明顯不同。表2結(jié)果顯示，經(jīng)過Welch檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組患者M(jìn)VD差異顯著(Welch=368.124，P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且各組之間經(jīng)兩兩t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除了正常組、單純增生組以及導(dǎo)管內(nèi)原位癌組、非典型增生組之間無明顯差異(P＞0.05)，其余兩組之間均差異顯著(P＜0.05)。同時(shí)，隨著患者病情的逐漸加重，患者乳腺M(fèi)VD也不斷升高。此外，各組患者VEGF、Flk-1/KDR值從正常組到浸潤性導(dǎo)管癌組不斷升高，經(jīng)過F檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組患者VEGF、Flk-1/KDR差異顯著(F=26.41，F(xiàn)=23.65，P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組之間經(jīng)兩兩t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除了正常組、單純增生組以及導(dǎo)管內(nèi)原位癌組、非典型增生組之間無明顯差異(P＞0.05)，其余兩組之間均差異顯著(P＜0.05)。圖1結(jié)果顯示，隨著各組患者M(jìn)VD值的升高，VEGF、Flk-1/KDR值也不斷增大，MVD的升高可在一定程度上反映VEGF、Flk-1/KDR的變化趨勢。

綜上所述，乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著心血管的形成以及VEGF、Flk-1/KDR受體的表達(dá)，超聲造影通過對血管密度的監(jiān)測，可作為VEGF、Flk-1/KDR受體的表達(dá)情況的參考。