趙玉蓉 付 瑩 王紅權(quán),

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長沙 410128; 2. 水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 常德 415000)

在當(dāng)前高度集約化養(yǎng)殖模式下, 水體極易出現(xiàn)氨氮過量積累[1]。氨作為一種有毒物質(zhì), 在水體中過量積累時影響魚類的呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等, 從而出現(xiàn)抑制生長、阻礙離子平衡、降低機體免疫功能等多種不良影響[2—4]。α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, α-KG)作為三羧酸循環(huán)的中間體, 具有調(diào)節(jié)機體能量代謝、氮代謝、維持腸道健康和提高機體免疫力等多種功能[5—10]。大量研究表明, 飼糧中添加適量的α-KG能夠有效緩解動物的熱應(yīng)激、脂多糖應(yīng)激、氧化應(yīng)激和草魚的急性氨氮脅迫[9—14], 但其緩解草魚氨氮脅迫的機制尚不清晰。本試驗以草魚(Ctenopharyngodon idellus)為對象, 研究α-KG對慢性氨氮脅迫下草魚鰓Na+/K+-ATP酶活性和血液生化指標(biāo)的影響, 以期為闡述α-KG緩解草魚氨氮脅迫機制和α-KG作為魚類抗氨氮應(yīng)激劑飼料的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

試驗用草魚購自湘陰巨豐漁業(yè)有限公司, 飼養(yǎng)于容積為250 L的塑料桶。選取體格相近的健康草魚270尾[初始體重為(24.79±0.11) g], 隨機分成3個處理組, 分別為對照組 (Ⅰ) (曝氣后的自來水、氨氮濃度為1.51 mg/L, 飼喂基礎(chǔ)飼糧)、氨氮組 (Ⅱ)(曝氣后的自來水、氨氮濃度為18.37 mg/L, 飼喂基礎(chǔ)飼糧)和α-KG組 (Ⅲ) (曝氣后的自來水、氨氮濃度為18.37 mg/L, 飼喂α-KG飼糧), 每處理組設(shè)3個重復(fù)桶, 每個重復(fù)桶放養(yǎng)30尾魚。

1.2 試驗飼料

根據(jù)草魚配合飼糧標(biāo)準(zhǔn)(SCT 1024-2002)配制基礎(chǔ)飼糧, 配方及營養(yǎng)成分見表1。根據(jù)本課題組的前期研究, 草魚飼糧中α-KG的適宜添加量為7.5 g/kg[15]。因此, 本試驗以7.5 g/kg α-KG等量替代基礎(chǔ)飼糧中次粉, 配制α-KG飼糧。用逐級稀釋混合擴大法將飼料原料混合均勻, 制成直徑2 mm的顆粒料, 自然風(fēng)干后置于–20℃保存?zhèn)溆谩＆?KG購自湖北遠成集團, 純度99.8%。

1.3 飼養(yǎng)管理

根據(jù)參考文獻[14, 16, 17], 設(shè)計本試驗氨氮組和α-KGr組的氨氮脅迫濃度為18.36 mg/L, 采用10 g/L的氯化銨母液調(diào)制。養(yǎng)殖試驗在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水族基地進行, 所有試驗用魚提前15d飼養(yǎng)于試驗桶中, 以適應(yīng)試驗環(huán)境。正式試驗期間, 每天上午9: 00和下午5: 00投喂相應(yīng)飼糧, 日投食量為魚體重的3%左右, 投喂1h后吸出殘餌和糞便, 然后換水(約1/3體積), 分別用氯化銨母液、氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)整養(yǎng)殖水體的氨氮濃度和pH以維持試驗所需環(huán)境。另外, 每天13:00和22:00監(jiān)測水體氨氮濃度、溫度和pH, 并24h連續(xù)充氧。養(yǎng)殖期間各處理組的氨氮含量及其他實測值分別為:對照組、氨氮組和α-KG組的水體氨氮分別為1.51±0.08、18.71±0.62和18.26±0.40, 水溫為(27.25±2.51)℃,pH為6.55±0.29, 草魚成活率100%。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測定

采樣時間分別為第1、第14、第28和第42天,采樣當(dāng)天早晨禁食。每次采樣時, 每桶隨機選取4尾魚, 經(jīng)MS222麻醉后用2.5 mL無菌注射器尾靜脈采血, 用1 g/L的肝素鈉溶液抗凝, 3500×g4℃離心10min, 取上層血漿于–40℃保存?zhèn)溆谩⒉蒴~置于冰上, 用鑷子取草魚兩側(cè)鰓組織, 用生理鹽水沖洗, 濾紙吸干水分, 保存于–40℃?zhèn)溆?。采用高效液相色譜-四級桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀測定血氨含量,深圳邁瑞B(yǎng)S-200全自動生化分析儀分別測定血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransaminase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase, AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)活性及尿素(UREA)、球蛋白(Globulin, GLB)的含量。鰓Na+/K+-ATP酶活性采用南京建成生物工程研究所的超微量Na+/K+-ATPase試劑盒測定, 嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析, 并用Duncan氏法進行多重比較, 試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P＜0.05時為差異顯著, 反之為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 鰓Na+/K+-ATP酶活性

如圖1所示, 氨氮脅迫后第28天, 氨氮組Na+/K+-ATP酶活性顯著低于對照組和α-KG組(P＜0.05), 但α-KG組的Na+/K+-ATP酶活性與對照組的差異不顯著。第1、第14和第42天, 3組間Na+/K+-ATP酶活性均無顯著差異。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平Tab. 1 Composition and nutrient levels of basal diet

2.2 血液生化指標(biāo)

統(tǒng)計分析結(jié)果表明(圖2), 氨氮脅迫后1d, 3個處理組間草魚血氨含量存在顯著差異。氨氮組草魚血氨含量較對照組顯著升高(P＜0.05), 而α-KG的添加有效降低了α-KG組草魚的血氨含量(P＜0.05)。而氨氮脅迫后14d、28d和42d, 3個處理組草魚血氨含量無顯著差異(P＞0.05)。

氨氮脅迫后第1天, 氨氮組和α-KG組血漿ALT活性均顯著低于對照組(P＜0.05), 但2組間無顯著差異(P＞0.05)。第14天, 氨氮組ALT活性低于對照組和α-KG組, 但3組間ALT活性無顯著差異(P＞0.05)。第28和第42天, 氨氮組ALT活性顯著低于對照組(P＜0.05)和α-KG組(P＜0.05), 但對照組和α-KG組間無顯著差異(P＞0.05)。血漿AST活性在第1和第28天, 3組間無顯著差異。第14天, 氨氮組血漿AST活性較對照組和α-KG組顯著升高(P＜0.05), 但對照組和α-KG組間無顯著差異。第42天, 氨氮組和α-KG組AST活性無顯著差異, 但均顯著高于對照組(P＜0.05)。

氨氮脅迫后第1天, 氨氮組和α-KG組血漿UREA含量無顯著差異, 但均較對照組顯著降低(P＜0.05)。第14和第42天, 3組間血漿UREA含量均無顯著差異。但第28天, 氨氮組血漿UREA含量顯著低于對照組和α-KG組(P＜0.05), 而對照組和α-KG組間血漿UREA含量無顯著差異。

在氨氮脅迫后第1和第14天, α-KG組血漿GLB含量高于對照組和氨氮組, 但3組間差異不顯著(P＞0.05)。第28天, 氨氮組與對照組相比, 血漿GLB含量無顯著差異, 但α-KG組血漿GLB含量顯著高于對照組和氨氮組(P＜0.05)。第42天, 對照、氨氮、α-KG組間血漿GLB含量無顯著差異。

在氨氮脅迫后第1和第14天, 3組間血漿ALP活性無顯著差異, 但第14天, α-KG有緩解氨氮脅迫導(dǎo)致的血漿ALP酶活升高的趨勢。第28天, 氨氮組ALP活性與對照組相比無顯著差異, 但顯著高于α-KG組(P＜0.05)。第42天時, 3組間血漿ALP活性無顯著差異, 但α-KG組血漿ALP活性較低。

3 討論

在本試驗中, 氨氮脅迫1d后, 草魚血氨含量顯著升高, 而α-KG的添加能夠有效緩解草魚血氨含量的升高, 這說明α-KG能在一定程度上有效緩解氨氮脅迫。而14d、28d和42d, 3組草魚間血氨含量差異不顯著, 這說明草魚對一定濃度的環(huán)境氨氮脅迫有一定的自我調(diào)節(jié)適應(yīng)能力。

鰓不僅是魚類的呼吸器官, 還參與機體的氨氮排泄、滲透壓調(diào)節(jié)等。鰓上皮的泌氯細(xì)胞是魚類機體離子排出的主要功能細(xì)胞, Na+/K+-ATP酶則位于該細(xì)胞的表面, 能通過耗能泵出Na+吸收K+以維持體內(nèi)的滲透壓, 而NH4+能夠代替K+在Na+/K+-ATP酶上的位點與其結(jié)合, 因此Na+/K+-ATP酶與NH4

+的轉(zhuǎn)運密切相關(guān)[18,19]。本試驗結(jié)果表明, 第28天氨氮組鰓Na+/K+-ATP酶活顯著低于對照組和α-KG組, 而對照組和α-KG組間差異不顯著, 這說明慢性氨氮脅迫導(dǎo)致了草魚鰓的氨轉(zhuǎn)運受到抑制, 而飼糧α-KG能夠有效緩解該現(xiàn)象。這可能是因為α-KG作為三羧酸循環(huán)的中間體, 能夠提供Na+/K+-ATP酶進行離子轉(zhuǎn)運時所需的能量, 從而有利于Na+/K+-ATP酶活的維持。第42天3組間鰓Na+/K+-ATP酶活差異不顯著, 可能是因為草魚對氨氮的慢性脅迫出現(xiàn)了適應(yīng), 這與Wei等[20]在鯽(Carassius auratus)上的研究結(jié)果相似。但是, Francois等[21]發(fā)現(xiàn)鱈(Gadus morhua)經(jīng)過長期氨氮脅迫(0—0.17 mg/L)之后, 鰓Na+/K+-ATP酶活性并未受到影響, 而Alam和Frankel[22]發(fā)現(xiàn)銀鱸(Bidyanus bidyanus)和金鱸(Macquaria ambigua)在氨氮脅迫(0—5 mg/L)下, 鰓Na+/K+-ATP酶活性隨著氨氮濃度升高而升高, 這些不同結(jié)果的得出可能與試驗所用氨氮濃度、試驗魚的種類和生存水環(huán)境的鹽度(淡水和海水)等不同有關(guān)。

肝臟作為重要的代謝器官, 是魚類解毒的主要場所。ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞內(nèi), 當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時, 會大量從細(xì)胞進入血液。因此, 血液中ALT和AST活性是肝臟損傷最敏感的檢測指標(biāo)。此外, 這2種轉(zhuǎn)氨酶在非必需氨基酸的合成和蛋白質(zhì)的分解代謝中也起著重要的作用。在本試驗中, 氨氮脅迫后14d, 氨氮組草魚血漿AST酶活顯著高于對照組和α-KG組, 這說明一定濃度的氨氮脅迫14d后對草魚肝臟造成了一定的損傷, 而飼糧中添加適量的α-KG能在一定程度上緩解氨氮脅迫對肝臟的損傷。第28天, 氨氮組草魚血漿AST酶活顯著升高現(xiàn)象消失, 3組間無顯著差異, 這可能與草魚對一定濃度的氨氮脅迫有所適應(yīng)相關(guān), 但還有待進一步證實。然而, 在長達42d的氨氮脅迫后, 氨氮組和α-KG組的AST含量均出現(xiàn)顯著升高, 這說明在長期的慢性氨氮脅迫下, 草魚肝臟受到損傷。此外,在氨氮脅迫后28d和42d, 血漿中ALT含量顯著降低,這是否與動物為了適應(yīng)氨氮脅迫環(huán)境, 從而抑制機體蛋白質(zhì)的分解、減少體內(nèi)氨氮產(chǎn)生相關(guān), 還有待進一步研究。而α-KG組血漿ALT活性僅在第1天降低, 這說明飼糧中添加適宜的α-KG能減緩慢性氨氮脅迫造成的草魚機體蛋白質(zhì)代謝紊亂。

尿素氮是血液中主要的非蛋白質(zhì)含氮物, 可以反映體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝和腎功能的狀況[23]。由于機體中的氨轉(zhuǎn)換為尿素需要消耗大量的能量, 所以在一般情況下, 水生動物氮代謝產(chǎn)物多以氨的形式排泄, 少量以尿素形式排泄。在本試驗中, 氨氮脅迫后1d, 氨氮組和α-KG組血液中尿素含量均顯著低于對照組, 這可能是由于動物為了彌補氨氮脅迫帶來的額外能量需求[24], 從而抵制機體的尿素合成。第28天, 氨氮組血液尿素含量依舊顯著低于對照組, 而α-KG組血液尿素含量與對照組無顯著差異, 這說明α-KG作為三羧酸循環(huán)的中間體, 對機體有補充能量的作用, 從而能一定程度地緩解動物應(yīng)激時的額外能量消耗, 維持機體的代謝平衡。隨著氨氮脅迫時間的進一步延長, 各組間血漿尿素含量差異不顯著, 這可能是在長期慢性氨氮脅迫下, 草魚自身出現(xiàn)適應(yīng)性調(diào)節(jié)。

GLB由漿細(xì)胞分泌形成, 能夠反映機體的抵抗能力[25]。在本試驗中, 氨氮脅迫1d和14d后, α-KG組血漿GLB有增加的趨勢; 脅迫28d后, 血漿GLB含量得到顯著提高, 這表明日糧添加α-KG對草魚氨氮脅迫下的抵抗力有一定提高。ALP主要參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝過程以及體內(nèi)的鈣、磷代謝[26,27], 對動物體的骨骼礦化、物質(zhì)跨膜運輸、解毒等起重要作用, 當(dāng)組織或細(xì)胞受到損傷或誘導(dǎo)應(yīng)激時, 溶菌體會釋放該酶[28]。在本試驗中,氨氮脅迫后28d α-KG組血漿中ALP活性出現(xiàn)顯著降低, 說明飼糧適量α-KG的添加有利于氨氮脅迫下草魚的機體保護。

綜上所述, 飼糧α-KG的適量添加能夠顯著降低草魚氨氮脅迫所致的血氨含量升高, 維持氨氮脅迫下草魚機體鰓Na+/K+-ATP酶活、血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)按酶、堿性磷酸酶的活性和血漿球蛋白、尿素含量的穩(wěn)定, 從而有利于草魚緩解氨氮脅迫。