孫思睿,萬 峰,賀 菁,張 晟,孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

乳酸菌在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì),如細(xì)菌素、有機(jī)酸、過氧化氫等,其中細(xì)菌素以其優(yōu)良的性能被廣泛用于食品、醫(yī)藥等各個(gè)行業(yè)。隨著人們生活水平的提高,健康安全已經(jīng)成為食品生產(chǎn)的必然趨勢,細(xì)菌素可以有效地代替食品中化學(xué)防腐劑控制病原微生物的生長[1],一定程度上降低了化學(xué)添加劑對人體的不良影響,逐漸成為研究的熱點(diǎn)[2]。雖然目前商品化產(chǎn)品僅限于乳酸鏈球菌素Nisin和片球菌素pediocin等有限幾種,但迄今為止,研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1700多種細(xì)菌素,其中300余種為乳酸菌細(xì)菌素[3]。

目前,許多國家對Nisin在食品中的添加量已有明確限制,實(shí)驗(yàn)表明人體安全攝入量應(yīng)低于2.9 mg/人/日[4]。同時(shí)研究者也在不斷發(fā)掘更多安全且抑菌活性較強(qiáng)的細(xì)菌素,以助于更好的應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐,因此對細(xì)菌素抑菌活性的準(zhǔn)確檢測及結(jié)果的規(guī)范性表示顯得尤為重要。目前主要采用的檢測方法為瓊脂擴(kuò)散法和臨界稀釋法,但對細(xì)菌素效價(jià)的表示暫無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),因此本文旨在比較幾種常見的細(xì)菌素抑菌活性的測定方法,同時(shí)試圖給出細(xì)菌素抑菌活性結(jié)果準(zhǔn)確表示的通用方式。

1 乳酸菌細(xì)菌素

細(xì)菌素是核糖體在微生物生長代謝過程中產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽,當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)可以殺死或抑制某些微生物[5],因此可以有效地抑制食物中食源性微生物及某些腐敗菌的生長,起到生物防腐作用。

乳酸菌細(xì)菌素有多種分類方式,通常被分為三類:分別是羊毛硫細(xì)菌素、非羊毛硫抗生素和溶菌素[6]。細(xì)菌素通常在乳酸菌培養(yǎng)至對數(shù)生長末期或穩(wěn)定期前期[7]時(shí)產(chǎn)生,它們都通過非特異地吸附到細(xì)胞膜表面,使其形成孔洞后釋放水合氫離子和ATP,使質(zhì)子動(dòng)力(PFM)喪失[8],當(dāng)細(xì)菌素濃度達(dá)到一定閾值時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生抑菌作用;但能否與細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合,還要取決于細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)。幾種研究較為深入的乳酸菌細(xì)菌素如表1所示。雖然細(xì)菌素具有一定的抑菌活性,但并不意味著在任何條件下都能夠發(fā)揮應(yīng)有的效應(yīng),這不僅取決于細(xì)菌素自身的特性,還取決于對樣品處理的方式以及產(chǎn)細(xì)菌素菌株的培養(yǎng)環(huán)境等。此外,細(xì)菌素在應(yīng)用過程中也可能面臨著溶解度較低,易被一些蛋白酶類食物組分降解等風(fēng)險(xiǎn),以及產(chǎn)量小純度較低需要經(jīng)過復(fù)雜的純化后才能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)等劣勢[9],因此在一定的條件下準(zhǔn)確測定其抑菌活性以及保證其能發(fā)揮應(yīng)有的效力顯得尤為重要。

表1 當(dāng)前研究較深入的乳酸菌細(xì)菌素Table 1 The current study on bacteriocins secreted by Lactic acid bacteria

2 含細(xì)菌素?zé)o細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備

微生物培養(yǎng)物經(jīng)處理后制備成無細(xì)胞發(fā)酵上清液后才能夠用于測定細(xì)菌素抑菌活性,主要包括:離心、中和、添加過氧化氫酶除去H2O2等其他抗菌物質(zhì)的干擾[29]。

培養(yǎng)物在離心處理前應(yīng)考慮該菌所產(chǎn)細(xì)菌素是僅存在于上清液中,還是會(huì)一定程度地吸附于菌體細(xì)胞上,以此為依據(jù)來判斷是否僅進(jìn)行簡單的離心操作來制備無細(xì)胞發(fā)酵上清液。Gong等[30]對細(xì)菌素plantarumMG進(jìn)行pH和溫度耐受性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明該細(xì)菌素在pH2.00～10.00的范圍內(nèi)均保持較好的抑菌活性,且在121 ℃下加熱30 min后,抑菌活性也并未降低。但是由于細(xì)菌素自身的性質(zhì)不同,為提高抑菌活性檢測的準(zhǔn)確度,應(yīng)探究清楚細(xì)菌素本身對pH、溫度以及其它營養(yǎng)組分等環(huán)境因素的耐受能力,以免在后續(xù)處理過程中活性下降影響測定結(jié)果。有研究懷疑將培養(yǎng)物透過0.22 μm濾膜可能會(huì)影響細(xì)菌素的抑菌活性[31],但是Van[32]成功地將大腸桿菌素E2-P9(0)通過該孔徑濾膜而并未損失抑菌活性,因此在現(xiàn)今的實(shí)驗(yàn)中仍然采用濾膜過濾的方式除菌,暫時(shí)忽略其可能產(chǎn)生的影響。

某些菌株所產(chǎn)細(xì)菌素的濃度較低不利于后續(xù)檢測,可以采用濃縮方法,或?qū)⑵浼兓笤龠M(jìn)行測定。樣品通常要低溫保藏,且注意保藏時(shí)間和避免反復(fù)凍融,有實(shí)驗(yàn)稱反復(fù)凍融三次后細(xì)菌素效價(jià)會(huì)有所下降[33]。Bifidodacteriumspp. 在-20 ℃或-70 ℃下貯藏1～3個(gè)月,其效價(jià)便由原來的51200 AU/mL降至30000 AU/mL,而當(dāng)貯存于-4 ℃時(shí),抑菌活性則降至原來的75%[34]。

3 細(xì)菌素抑菌活性測定方法

3.1 瓊脂擴(kuò)散法(AWDA,Agar well diffusion assay)

起初采用臨界稀釋法測定細(xì)菌素的抑菌活性,但鑒于瓊脂擴(kuò)散法在檢測抗生素活性上有很好的應(yīng)用,所以在Tramer等[35]提出將該方法應(yīng)用于細(xì)菌素抑菌活性的檢測。根據(jù)媒介不同,又可將其分為牛津杯法、雙層平板打孔法和濾紙片法等。

很多因素會(huì)影響抑菌活性測定結(jié)果,如指示菌的數(shù)量、培養(yǎng)時(shí)間、擴(kuò)散時(shí)間和溫度以及上樣量等,因此該方法也在不斷地被完善。培養(yǎng)基中瓊脂含量會(huì)影響細(xì)菌素的擴(kuò)散速度,通常含量越高擴(kuò)散速度越慢,但為保證其凝固效果,也不能一味的降低培養(yǎng)基中瓊脂的量。Wolf和Gibbons[36]發(fā)現(xiàn)當(dāng)瓊脂質(zhì)量濃度為7.5 g/L有助于細(xì)菌素的擴(kuò)散;同時(shí)添加一定量的緩沖溶液可以有效緩解低pH對抑菌效果造成的影響。國標(biāo)GB1886.231-2016[37]在檢測Nisin活性時(shí),向培養(yǎng)基中加入一種表面活性劑吐溫20,促進(jìn)細(xì)菌素的擴(kuò)散,擴(kuò)散的越完全會(huì)使得其測定的抑菌活性更準(zhǔn)確。檢測Nisin抑菌活性時(shí)發(fā)現(xiàn),將上樣后的平板置于4 ℃下擴(kuò)散,既不會(huì)使指示菌生長,又能提高檢測準(zhǔn)確度,Lalpuria等[38]基于上述研究后發(fā)現(xiàn),孔徑為7 mm抑菌圈直徑大于孔徑為3 mm時(shí),但孔徑較小時(shí)精度更高;同時(shí)對最佳擴(kuò)散時(shí)長進(jìn)行建模發(fā)現(xiàn),總體而言,擴(kuò)散48 h后測定結(jié)果準(zhǔn)確度最高。由于不同細(xì)菌素其自身特性的不同,導(dǎo)致其分離及測定參數(shù)不能一概而論,應(yīng)根據(jù)每一個(gè)步驟中面臨的實(shí)際問題,來確定最終的測定方法。

3.2 臨界稀釋法(CDA,Critical dilution assay)

臨界稀釋法可以分為試管稀釋法(TDA,Tube dilution assay)、96孔板法以及濁度法(TA,Turbidometric assay)等,其本質(zhì)均為半定量測定[39]。臨界稀釋法是將待測樣品梯度稀釋,再以一定量加入到含指示菌的培養(yǎng)基中,通過測定吸光值或指示菌活菌數(shù)的變化,最終確定對指示菌生長的抑制率。但需要注意的是,含細(xì)菌素的粗提液中含有一定的營養(yǎng)成分,可能會(huì)為指示菌的生長提供額外的營養(yǎng),為了排除此影響,可以將樣品透析,剔除小分子營養(yǎng)物質(zhì),盡可能保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。臨界稀釋法與瓊脂擴(kuò)散法的區(qū)別見表2所示。

表2 細(xì)菌素抑菌活性測定方法比較Table 2 A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity

3.3 其他檢測方法

3.3.1 ELISA測定細(xì)菌素抑菌活性 ELISA檢測是將已知量的Nisin溶液涂層于孔板中,添加過量未標(biāo)記的抗體共同孵育一定時(shí)間后,洗去未結(jié)合抗體,加入酶標(biāo)記抗體,最后添加底物顯示熒光信號(hào)。Chollet等[40]測定食品基質(zhì)中脂肪對細(xì)菌素?cái)U(kuò)散效率的影響時(shí)將Nisin與抗血清進(jìn)行競爭性免疫測定,用已知濃度的乳鏈菌肽制備內(nèi)容物,通過反擴(kuò)散將Nisin從不同脂肪含量的瓊脂糖凝膠中提取并測量。采用ELISA方法檢測出Nisin擴(kuò)散時(shí)間與擴(kuò)散深度的回歸方程并建立模型,較為準(zhǔn)確的檢測凝膠中Nisin的免疫活性。ELISA相對于觀察抑菌圈的大小來說更加的準(zhǔn)確和敏感,它通常應(yīng)用于建立細(xì)菌素的擴(kuò)散效率模型,從而對細(xì)菌素進(jìn)行定量檢測。

3.3.2 ATP生物熒光法測定細(xì)菌素抑菌活性 細(xì)胞內(nèi)含有大量的ATP,可與熒光素發(fā)生反應(yīng),Nina等[41]開發(fā)了一種基于生物發(fā)光傳感器檢測食品中超低量乳酸菌肽的方法,他們將細(xì)菌螢光素酶操縱子luxABCDE置于質(zhì)粒pNZ8048中的nisA啟動(dòng)子的控制下,并轉(zhuǎn)化到兩株乳酸乳球菌中。這些菌株的nisRK基因使其感受乳鏈菌肽并傳遞信號(hào),起始nisA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。由于構(gòu)建的乳酸鏈球菌素生物傳感器菌株NZ9000lux和NZ9800lux經(jīng)乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)后發(fā)光,且信號(hào)量隨乳酸鏈球菌素含量的增加而增加,因此可以通過發(fā)光強(qiáng)度來檢測Nisin的含量。在細(xì)菌素的檢測上,該技術(shù)不需要添加額外的外源底物,利用傳感器直接通過實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)檢測生物發(fā)光情況,操作簡單且費(fèi)時(shí)較短,對于不透明或是指示劑難于選擇的樣品有很好的應(yīng)用;但易受到游離ATP的干擾,以及反應(yīng)體系的最佳條件難以摸索[42]。

除此之外,抑菌活性的測定還可以采用毛細(xì)管電泳、電導(dǎo)測定以及輻射法等。相比于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法而言,這些方法由于相對成本較高且具有一定特異性,目前暫未在實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。但是儀器操作使得結(jié)果更加準(zhǔn)確高效,且重復(fù)性更高。這些研究的推進(jìn)也表明:迫切需要建立一種高效便捷的細(xì)菌素抑菌活性的測定方法。

4 細(xì)菌素效價(jià)的表示方法

通常以三種形式表示細(xì)菌素的效價(jià):即國際單位IU/mL、任意單位AU/mL以及細(xì)菌素效價(jià)自定義單位BU/mL。

4.1 以Nisin為基準(zhǔn)定義細(xì)菌素效價(jià)

由于Nisin效價(jià)已被定義為106IU/g,因此可以以抑菌圈直徑或生長抑制率為縱坐標(biāo),以Nisin的不同稀釋濃度對應(yīng)的效價(jià)值作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Delgado等[43]測定四株乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌活性,以Nisin為對照,將測定結(jié)果直接帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算待測細(xì)菌素的效價(jià)。此外,賴文等[44]在測定戊糖乳桿菌B8產(chǎn)細(xì)菌素動(dòng)力模型時(shí),也采用該方式以Nisin作為基準(zhǔn)確定待測細(xì)菌素效價(jià)。據(jù)此劉國榮等[45]將純化后的細(xì)菌素BB04的效價(jià)定義為640 IU/mL。

由于Nisin只有在一定濃度范圍內(nèi)才呈線性關(guān)系,而濃度的確定與指示菌的選擇密不可分。Papagianni等人[46]以不同的菌株作為指示菌,發(fā)現(xiàn)無論采用何種抑菌活性測定方法,在較低的Nisin濃度下,只有對L.curvatusATCC51436和P.acidilacticiATCC25740的抑制率才與濃度呈線性關(guān)系,而對L. sakei的抑制率在Nisin活性為40～1000 IU/mL范圍時(shí)才呈良好線性關(guān)系(見圖1)。

4.2 臨界稀釋法以AU/mL為單位定義細(xì)菌素效價(jià)

在目前的研究性試驗(yàn)中,細(xì)菌素效價(jià)最常用的表達(dá)方法為AU/mL,且采用該定義方法時(shí)通常采用瓊脂擴(kuò)散法。1 AU/mL被定義為能夠產(chǎn)生明顯抑菌圈的最高稀釋度的倒數(shù)[47-48]。目前得到最廣泛的認(rèn)可。效價(jià)的計(jì)算過程簡述如下。先簡單的進(jìn)行系列梯度稀釋,以稀釋過程中能出現(xiàn)明顯抑菌圈的稀釋度記為稀釋因子D,而每孔中的濃度:

通過計(jì)算:

根據(jù)各個(gè)不同稀釋度所對應(yīng)抑菌圈的大小繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線R=a+blog(d)(式中：R代表抑菌圈直徑mm或抑菌圈面積mm2),可以分別得出斜率b與截距a的值。則細(xì)菌素效價(jià)[49]:

本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)此方法測定植物乳桿菌1.0391在37 ℃培養(yǎng)20 h時(shí)所產(chǎn)的細(xì)菌素效價(jià),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線R=9.1885x+4.4431(R2=0.9956)。

4.3 以BU/mL為單位定義細(xì)菌素效價(jià)

用濁度法測定細(xì)菌素活性時(shí)常采用BU/mL表示細(xì)菌素效價(jià)。指示菌的生長抑制率定義為I:

式中:A1為一定量細(xì)菌素與指示菌混合液的吸光值,A0為對照組,即等量無菌水與指示菌混合液的吸光值。

通過測定連續(xù)的稀釋濃度,找尋ID50即一半抑制濃度即(I=0.5),并將此濃度定義為1 BU/mL[50],通過稀釋度的倒數(shù)繪制反曲線方程,計(jì)算待測細(xì)菌素的效價(jià)。三種細(xì)菌素效價(jià)表示方法的優(yōu)缺點(diǎn)如表3所示。

表3 細(xì)菌素效價(jià)表示方法的比較Table 3 A comparison of the representation of bacteriocin titer

5 結(jié)論與展望

雖然瓊脂擴(kuò)散法操作復(fù)雜且受到很多因素影響,但仍然是抑菌活性測定的主流方法。然而隨著研究的逐步推進(jìn),廉價(jià)實(shí)用的試劑盒以及更精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)儀器必將替代手動(dòng)方式作為高效的檢測手段。目前人們已經(jīng)基于Nisin,對影響抑菌活性測定的pH、擴(kuò)散溫度及時(shí)間、處理方式等一系列相關(guān)因素進(jìn)行了較為詳盡的研究,期望最大限度地優(yōu)化測定方法,以減小實(shí)驗(yàn)誤差,也獲得了一定成效。此外,目前主要采用AU/mL和IU/mL兩種表示方法定義細(xì)菌素效價(jià),而任意單位AU在國際范圍內(nèi)的應(yīng)用更為廣泛,也得到大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可;但由于其是以自身抑菌能力為標(biāo)準(zhǔn),雖然在實(shí)驗(yàn)中可以通過比較而得出對比結(jié)果,但是若比較兩種或多種不同的細(xì)菌素的抑菌活性時(shí),同樣存在諸多不便。因此,在未來的研究中首先應(yīng)盡量創(chuàng)造合適的生產(chǎn)環(huán)境來保證乳酸菌細(xì)菌素的活性;其次,仍需要找尋一種改良或替代瓊脂擴(kuò)散法的方法,以便提高細(xì)菌素抑菌活性測定的準(zhǔn)確性,更好的挖掘抑菌活性較強(qiáng)的生物防腐劑;此外還應(yīng)探索建立應(yīng)用更加廣泛且具有高認(rèn)可度的細(xì)菌素效價(jià)表示方法。相信隨著科技的發(fā)展以及研究的進(jìn)一步完善,更多的乳酸菌細(xì)菌素將被合法使用,乳酸菌細(xì)菌素將會(huì)廣泛地應(yīng)用到食品防腐、疾病治療等更多領(lǐng)域。