王 琴，鄒自英，譚積善，劉 媛，連麗莎

腸桿菌科細(xì)菌是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，碳?xì)涿赶╊愃幬锸侵委熌c桿菌科細(xì)菌感染的首選抗生素之一。近年來(lái)，耐碳?xì)涿赶╊愃幬锬c桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobactericacea，CRE)不斷出現(xiàn)，沖擊著碳?xì)涿赶╊愃幬镌谥委熌c桿菌科細(xì)菌感染中的地位。2017年2月WHO將CRE列為極為重要的迫切需要新型抗菌藥物的細(xì)菌成為目前全球關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。為了解我院CRE的流行現(xiàn)狀，本文收集我院2014-2016年分離3262株腸桿菌科細(xì)菌并對(duì)其耐藥性進(jìn)行分析，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株：我院2014-2016從臨床各科標(biāo)本中分離獲得的137株CRE。CRE納入標(biāo)準(zhǔn)為2015年美國(guó)疾病控制及預(yù)防中心頒布的標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)CRE防控指南》)，即亞胺培南(IMI)最低抑菌濃度(MIC)≥4μg/ml和(或)厄他培南(ETP)最低抑菌濃度(MIC)≥2μg/ml

1.2儀器與試劑 VITEK2-compact全自動(dòng)微生物分析鑒定儀、GNI鑒定卡、AST-GN13藥敏卡均為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品。美羅培南(MPN)紙片為北京天壇生物科技有限公司產(chǎn)品。MH瓊州平板為鄭州貝瑞特生物公司產(chǎn)品。胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)為Oxoid產(chǎn)品。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、陰溝腸桿菌ATCC700323、肺炎克雷伯菌ATCCBAA1705和ATCCBAA1706購(gòu)自中國(guó)工業(yè)菌種保藏所。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版采集分離培養(yǎng)標(biāo)本，獲得純培養(yǎng)后，采用GNI鑒定卡和AST-GN13藥敏卡在VITEK2-compact鑒定儀上進(jìn)行菌株鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，并用紙片擴(kuò)散法(K-B)作為補(bǔ)充試驗(yàn)。

1.3.2mCIM試驗(yàn) 取1μl接種環(huán)的過(guò)夜培養(yǎng)純菌落于2 ml TSB肉湯中，震蕩混勻10 s；每管放入一張含10μg美羅培南的無(wú)菌紙片，確認(rèn)紙片浸沒(méi)于菌懸液中，37℃環(huán)境孵育4 h；孵育結(jié)束時(shí)，立即用生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊腁TCC25922菌懸液，密涂MH平板15 min內(nèi)完成，干燥3 min；用10μl接種環(huán)將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出，將紙片貼于試管內(nèi)壁，輕輕按壓以擠去紙片上多余水分，然后將紙片取出，貼于已涂布ATCC25922的MHA平板上。37℃過(guò)夜孵育；量取抑菌圈直徑。陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm 或直徑為16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，若待測(cè)株產(chǎn)生碳青霉烯酶，紙片中的美羅培南被該酶降解，結(jié)果為無(wú)抑菌圈或抑制大腸埃希菌ATCC25922的活性降低。陰性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥19 mm。若待測(cè)菌株不產(chǎn)碳青霉烯酶，紙片中的美羅培南不被水解，仍能抑制大腸埃希菌ATCC 25922的生長(zhǎng)[2]。

1.3.3改良Hodge試驗(yàn) 使用無(wú)菌生理鹽水，將ATCC25922懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，并用生理鹽水進(jìn)行1∶10稀釋，用棉簽將稀釋后的懸液均勻涂布于MH瓊脂平板上，干燥10 min，將10μg美羅培南的無(wú)菌紙片貼于MH瓊脂平板中央。使用1μl的接種環(huán)挑取過(guò)夜生長(zhǎng)的菌落以美羅培南紙片為起點(diǎn)，沿離心方向劃線，長(zhǎng)度為20～30 mm。35℃環(huán)境孵育16～20 h，觀察結(jié)果。如果細(xì)菌在被測(cè)菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌交匯處大腸埃希菌生長(zhǎng)增強(qiáng)，即表明該菌株產(chǎn)碳?xì)涿瓜┟竅2]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié) 果

2.1CRE菌種構(gòu)成 137株CRE中，檢出大腸埃希菌45株(32.85%)、陰溝腸桿菌33株(24.09%)、肺炎克雷伯菌27株(19.71%)、檸檬酸桿菌14株(10.22%)、其他細(xì)菌18株(13.14%)。

2.2CRE來(lái)源標(biāo)本構(gòu)成 137株CRE標(biāo)本檢出痰液58株(42.34%)、尿液37株(27.01%)、血液11株(8.03%)、膽汁10株(7.30%)、其他標(biāo)本21株(15.33%)。

2.3CRE分布科室構(gòu)成 137株CRE檢出科室是ICU26株(18.98%)、普外22株(16.06%)、泌尿外科16株(11.68%)、腦外科12株(8.76%)、干部病房(8.76%)、康復(fù)醫(yī)學(xué)科10株(7.30%)、其他科室39株(28.47%)。

2.4腸桿菌科其他細(xì)菌與CRE菌株耐藥率比較 CRE耐藥率較腸桿菌科其他細(xì)菌耐藥率有明顯增加的趨勢(shì)，特別是碳青霉烯類藥物。其比較如下表1。

2.5mCIM試驗(yàn)及改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果 137株CRE中mCIM試驗(yàn)陽(yáng)性的細(xì)菌有37株，占總數(shù)的27.01%，結(jié)果見(jiàn)圖1。137株CRE改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性有34株，占總數(shù)24.82%，結(jié)果見(jiàn)圖2。兩種試驗(yàn)陽(yáng)性細(xì)菌構(gòu)成比見(jiàn)表2。

表1 腸桿菌科細(xì)菌與CRE菌株耐藥率比較

表2 mCIM試驗(yàn)及改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性菌株分布

圖1：mCIM試驗(yàn)結(jié)果

說(shuō)明：陽(yáng)性：美羅培南抑菌圈直徑為6～15mm；陰性：抑菌圈直徑≥19mm。

圖2：改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果

3討 論

腸桿菌科細(xì)菌是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，可致化膿性疾病、肺炎、腦膜炎、菌血癥以及傷口、泌尿道和腸道感染。由于多重耐藥菌檢出率的增加，給臨床抗感染治療帶來(lái)越來(lái)越多的挑戰(zhàn)。碳?xì)涿赶╊惪咕幬镆蚩咕秶鷱V，具有良好的膜通透性，是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC酶)腸桿菌科細(xì)菌感染的主要抗菌藥物之一，在臨床中得到了廣泛應(yīng)用[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)檢出病原菌主要為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌，與資料[4-6]顯示一致。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示CRE細(xì)菌感染來(lái)源最高為呼吸道感染，其次為尿路感染和血液感染；呼吸道和尿道與外界相通，一旦患者免疫力下降，患者住院接觸到醫(yī)院病原菌機(jī)會(huì)增多就會(huì)增加感染機(jī)會(huì)；且呼吸道和尿道插管時(shí)無(wú)菌操作不當(dāng)也是引起感染的重要因素。有資料顯示[7-8]，氣管插管和感染前抗菌藥物使用是CRE感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CRE檢出率最高的科室為ICU、康復(fù)醫(yī)學(xué)、外科及干部病房。ICU等重癥病人大量廣譜抗菌藥物的應(yīng)用增加了CRE的感染。研究中的10例康復(fù)醫(yī)學(xué)科病人均為腦外傷或腦術(shù)后病人，外科手術(shù)等侵入性操作以及術(shù)后長(zhǎng)期住院增加了CRE感染機(jī)會(huì)。干部病房多為老年病人，提示有基礎(chǔ)病的老年人是CRE的易感人群，應(yīng)重點(diǎn)防控。CRE較其他腸桿菌科細(xì)菌耐藥率明顯增高，對(duì)多數(shù)藥物的耐藥率>30%，且大多數(shù)藥物耐藥率>50%，總體對(duì)碳?xì)涿瓜╊惪股赜赡c桿菌科細(xì)菌的2.32%～2.41%增加到60.08%～62.40%，僅對(duì)阿米卡星和妥布霉素的耐藥率較低，為11.56%和30.67%，這在很大程度上限制了臨床用藥的選擇。產(chǎn)碳?xì)涿赶┟傅募?xì)菌能水解或滅活碳?xì)涿赶╊惪股?當(dāng)檢測(cè)到碳?xì)涿赶╊愃幬锬退幍哪c桿菌科細(xì)菌是應(yīng)用mCIM試驗(yàn)或改良Hodge試驗(yàn)驗(yàn)證。該研究中，有32株細(xì)菌mCIM試驗(yàn)和改良Hodge試驗(yàn)均陽(yáng)性；2株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，mCIM試驗(yàn)陰性；5株細(xì)菌mCIM試驗(yàn)陽(yáng)性，改良Hodge試驗(yàn)陰性。兩種試驗(yàn)中，有一種或兩種陽(yáng)性其ETPMIC值均≥8μg/ml，IPMMIC值均≥16μg/ml，提示當(dāng)ETPMIC≥8μg/ml，IPMMIC≥16μg/ml時(shí)，該菌株產(chǎn)碳青霉烯酶可能行更高。

mCIM試驗(yàn)和改良Hogde試驗(yàn)陽(yáng)性細(xì)菌多數(shù)藥物的敏感率<40%，但對(duì)阿米卡星的敏感率較高，為92.86%，其原因可能是由于兩類抗菌藥物的耐藥機(jī)制不同，CRE耐藥機(jī)制主要包括主動(dòng)外排系統(tǒng)、產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺少或數(shù)量減少[9]；而氨基糖苷類耐藥細(xì)菌主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶[10]。

隨著抗生素的不斷使用，耐碳青霉烯類藥物細(xì)菌的不斷出現(xiàn)，而新藥物有無(wú)法短時(shí)間研究出來(lái)，因此加強(qiáng)對(duì)此類藥物的監(jiān)管，依據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)合理用藥，做好隔離措施，提高醫(yī)務(wù)人員的無(wú)菌操作觀念，增強(qiáng)對(duì)免疫力低的人群的防控，預(yù)防該類細(xì)菌的大范圍傳播極為重要。