張蓉，盧王，張靜瑜，秦明，王景杰

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是臨床上最常見的功能性胃腸疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。該病的顯著特點(diǎn)是內(nèi)臟敏化[1]，即當(dāng)患者攝入辛辣食物、運(yùn)動或情緒激動時常誘發(fā)腸道發(fā)生過度的蠕動反應(yīng)，但是在正常人群中上述刺激并無此作用[2-4]。有研究表明，肥大細(xì)胞大量浸潤可能參與了IBS的內(nèi)臟敏化過程[5]。c-kit信號通路與IBS內(nèi)臟敏化密切相關(guān)[6-8]。有研究者提出IBS患者大量分泌胃腸道干細(xì)胞因子可刺激肥大細(xì)胞上的c-kit激酶活性，導(dǎo)致肥大細(xì)胞在腸道局部增生，并促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)，進(jìn)而引起內(nèi)臟敏化的發(fā)生[9-11]。在胃腸道，c-kit分布于Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)，并參與調(diào)節(jié)ICC的增殖和正常生理功能[12]。作為胃腸道的起搏細(xì)胞，ICC參與了胃腸道慢波形成和神經(jīng)肌肉信號傳遞過程，與胃腸動力密切相關(guān)[13]。肥大細(xì)胞與ICC在IBS內(nèi)臟敏化中發(fā)揮何種作用，以及c-kit信號上調(diào)是通過肥大細(xì)胞還是ICC來誘發(fā)內(nèi)臟敏化，值得深入研究。本研究采用色甘酸鈉(disodium cromoglycate，DC)抑制肥大細(xì)胞脫顆粒及ICC增殖，探討肥大細(xì)胞和ICC對IBS內(nèi)臟敏化的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑 清潔級雌性SD大鼠孕鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。羊抗兔IgG(1:500)、ABC復(fù)合物(1:500)、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑DC購自美國Sigma公司；兔抗c-kit血清(1:3000)購自美國Santa-Cruz公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗大鼠IgG抗體(1:1000)購自美國Jackson公司；甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate，STI-571)購自美國Abcam公司。

1.2 IBS造模及分組 采用清潔級雌性SD大鼠孕鼠，待孕鼠生產(chǎn)后，將母鼠與乳鼠分離喂養(yǎng)4周準(zhǔn)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[14]。采用腹部回縮反射法(AWR)對4周齡正常大鼠以及經(jīng)與母鼠分離處理后的模型大鼠進(jìn)行檢測。具體方法如下：乙醚麻醉大鼠，將測壓球囊經(jīng)直腸插入5cm，用膠布固定，置于安靜環(huán)境；待大鼠蘇醒后緩慢向球囊打氣，分別檢測引起大鼠腹部抬起及背部拱起的壓力閾值，每一閾值均重復(fù)檢測3次，每次持續(xù)30s，間隔5min，數(shù)據(jù)取平均值。采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計并計算正常大鼠壓力閾值的95%CI。經(jīng)與母鼠分離處理的大鼠壓力閾值如果超出此95%CI上限，即視為造模成功[15-16]。

實(shí)驗(yàn)共分7組，每組10只。正常對照組(A組)：正常大鼠，不加干預(yù)；結(jié)腸擴(kuò)張組(B組)：給予結(jié)腸擴(kuò)張刺激；IBS模型組(C組)：造模成功的IBS大鼠，不加干預(yù)；IBS結(jié)腸擴(kuò)張組(D組)：造模成功的IBS大鼠，給予結(jié)腸擴(kuò)張刺激；IBS+STI-571組(E組)：造模成功的IBS大鼠，腹腔注射STI-571 0.5ml/(kg·d)，連續(xù)5d，再給予結(jié)腸擴(kuò)張刺激；IBS結(jié)腸擴(kuò)張+DC組(F組)：造模成功的IBS大鼠，腹腔注射DC 20mg/(kg·d)，連續(xù)5d后給予結(jié)腸擴(kuò)張刺激；IBS結(jié)腸擴(kuò)張+STI-571+DC組(G組)：造模成功的IBS大鼠，腹腔同時注射STI-571 0.5ml/(kg·d)和DC 20mg/(kg·d)，連續(xù)5d后給予結(jié)腸擴(kuò)張刺激。結(jié)腸擴(kuò)張方法為：將氣囊緩慢插入大鼠結(jié)腸至距離肛門35mm處固定約30s，靜置5min后再用注射器向氣囊注入1.0ml蒸餾水。

1.3 大鼠腹直肌肌電檢測 取每組5只大鼠，將電極置于大鼠腹中線兩側(cè)，電極間距3～4cm，采用RM6280B生物信號采集處理軟件(成都儀器廠生產(chǎn))記錄和分析腹壁肌電活動。記錄安靜無刺激狀態(tài)下的腹直肌放電幅值，維持30s。間期休息5min后，對結(jié)腸擴(kuò)張組進(jìn)行結(jié)腸擴(kuò)張刺激，再次記錄給予腸道壓力后的腹直肌放電幅值。電生理記錄儀參數(shù)設(shè)置：采集頻率40kHz，掃描速度200ms/div，靈敏度500μV，時間常數(shù)0.001s，濾波頻率3kHz。

1.4 激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠ICC增殖活化情況 每組取5只大鼠進(jìn)行灌注內(nèi)固定后立即剖腹，取乙狀結(jié)腸處0.4cm×0.2cm大小組織，置于含4%多聚甲醛固定液X-100的0.1mol/L PBS中固定6h(4℃)，取出標(biāo)本移入30%蔗糖液24h(4℃)。超低溫切片機(jī)(美國NUAIR公司)切片，厚10μm。將標(biāo)本置于0.3%H2O2–甲醇液中浸泡30min封閉內(nèi)源性過氧化物酶；用0.1% Triton浸泡30min，PBS漂洗；加入免疫血清稀釋的1:200 c-kit兔多抗，4℃孵育過夜(約14h)；第2天將切片和鋪片置于室溫下復(fù)溫1h，經(jīng)PBS漂洗后加入四甲基異硫氰酸羅丹明(TMRITC，1:60稀釋)標(biāo)記的抗兔IgG二抗及異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠IgG二抗，室溫孵育3h；PBS漂洗，將鋪片平置于載玻片上，與切片標(biāo)本同時采用60%緩沖甘油封片。每張鋪片或切片取4～6個視野，于激光共聚焦顯微鏡下觀察大鼠ICC增殖活化情況，并將數(shù)字化圖像儲存于LSCM系統(tǒng)中進(jìn)行圖像分析。

1.5 DCN神經(jīng)元單位放電測定 取每組另外5只大鼠進(jìn)行骶髓后連合核(dorsal commissural nucleus，DCN)神經(jīng)元單位放電測定。選擇S1處(參照Paxnos圖譜第2版，位于L6－S3之間)的錐板，將其咬除，暴露脊髓，去除硬脊膜，通過反饋式電熱毯將動物體溫控制在正常生理范圍內(nèi)[直腸溫度(37±1)℃]。采用單管玻璃微電極細(xì)胞外記錄的方法，以玻璃微電極(5～10MΩ)在暴露脊髓背側(cè)正中線約0.8～1.0mm、深度600～1000μm范圍內(nèi)尋找典型的電活動范圍(wide dynamic range，WDR)單細(xì)胞電位，待放電穩(wěn)定后開始記錄。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。熒光半定量結(jié)果經(jīng)ImageJ 1.43軟件處理得到熒光光度值。DCN放電頻率、熒光光度值、腹直肌電差異采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)及Nemenyi秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IBS大鼠內(nèi)臟敏化現(xiàn)象 各組大鼠腹直肌肌電檢測結(jié)果如圖1所示。未經(jīng)結(jié)腸擴(kuò)張刺激前，IBS大鼠腹直肌肌電頻率和幅度均高于正常對照組(A組vs.C組，P＜0.05)，即靜息狀態(tài)下IBS大鼠腹痛反應(yīng)高于正常大鼠。結(jié)腸擴(kuò)張刺激可導(dǎo)致正常及IBS大鼠腹痛反應(yīng)增高(A組vs.B組，C組vs.D組，P＜0.05)，且IBS結(jié)腸擴(kuò)張組的腹痛反應(yīng)明顯高于結(jié)腸擴(kuò)張組(B組vs.D組，P＜0.05，表1)，表明IBS大鼠存在內(nèi)臟敏化現(xiàn)象。

圖1 各組大鼠腹直肌肌電檢測結(jié)果(n=5)Fig.1 Test results of the the myoelectricity of rectus abdominis in each group of rats (n=5)

表1 各組大鼠腹直肌肌電檢測結(jié)果(±s，n=5)Tab.1 Test results of the myoelectricity of rectus abdominis in each group of rats (±s,n=5)

表1 各組大鼠腹直肌肌電檢測結(jié)果(±s，n=5)Tab.1 Test results of the myoelectricity of rectus abdominis in each group of rats (±s,n=5)

A.Group A (normal control); B.Group B (normal control with colonic expansion); C.Group C (IBS model); D.Group D (IBS model with colonic expansion); E.Group E (IBS model with colonic expansion and receiving STI-571); F.Group F (IBS model with colonic expansion and receiving DC); G.Group G (IBS model with colonic expansion and receiving both STI-571 and DC).(1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group D

Group Frequency (Hz) Amplitude (mV)A 2.18±0.11 32.33±1.24 B 2.85±0.15(1)(2) 40.18±0.50(1)(2)4.10±0.10(1)(2) 45.33±0.81(1)(2)D 13.20±0.20 144.10±1.43 E 2.40±0.07(2) 38.58±0.52(2)C F 13.18±0.30 142.9±1.98 G 2.44±0.12 39.63±1.95

2.2 DC抑制肥大細(xì)胞活性對IBS大鼠腹痛的影響 F組肌電頻率和幅度分別為(13.18±0.30)Hz和(142.90±1.98)mV，D組肌電頻率和幅度分別為(13.20±0.20)Hz和(144.10±1.43)mV，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，即采用DC抑制肥大細(xì)胞脫顆粒，并不能有效抑制接受結(jié)腸擴(kuò)張刺激的IBS大鼠的腹痛反應(yīng)。G組肌電頻率和幅度分別為(2.44±0.12)Hz和(39.63±1.95)mV，E組肌電頻率和幅度分別為(2.40±0.07)Hz和(38.58±0.52)mV，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，即在抑制ICC增殖的基礎(chǔ)上使用DC也不能抑制腹痛反應(yīng)，提示肥大細(xì)胞在IBS內(nèi)臟敏化中未發(fā)揮主導(dǎo)作用。此外，抑制ICC增殖可以有效降低IBS動物的腹痛反應(yīng)(D組vs.E組，P＜0.05，圖1，表1)。以上結(jié)果表明ICC而非肥大細(xì)胞在IBS內(nèi)臟敏化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

2.3 IBS內(nèi)臟敏化與ICC變化的關(guān)系 結(jié)腸刺激可導(dǎo)致正常大鼠結(jié)腸ICC密度輕微增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(A組vs.B組，P＞0.05)；IBS大鼠結(jié)腸ICC密度高于正常大鼠(P＜0.05)；對比C、D兩組發(fā)現(xiàn)，在IBS基礎(chǔ)上給予結(jié)腸球囊擴(kuò)張刺激進(jìn)一步加劇了IBS大鼠腸道ICC的增殖，導(dǎo)致ICC密度明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示IBS大鼠結(jié)腸內(nèi)ICC增殖活力明顯高于正常大鼠；通過D、E兩組比較發(fā)現(xiàn)，STI-571明顯抑制了IBS大鼠腸道的ICC增殖(P＜0.05)；而通過D、F兩組比較發(fā)現(xiàn)，DC對IBS大鼠腸道ICC增殖活化的作用不大(P＞0.05，圖2)。

2.4 IBS內(nèi)臟敏化過程中擴(kuò)張刺激引起的DCN放電頻率的變化 由圖3可見，正常狀態(tài)下大鼠(A組)放電頻率較為規(guī)律，IBS大鼠(B組)DCN放電頻率較穩(wěn)定，但明顯高于正常大鼠(P＜0.05)。給予結(jié)腸刺激后的IBS大鼠(D組)DCN放電頻率明顯增加，且高于正常結(jié)腸擴(kuò)張刺激大鼠(B組，P＜0.05)。與結(jié)腸刺激IBS大鼠(D組)相比，給予STI-571腹腔注射的結(jié)腸擴(kuò)張IBS大鼠(E組)DCN放電頻率明顯下降(P＜0.05)。給予DC腹腔注射的IBS結(jié)腸擴(kuò)張大鼠(F組)DCN放電頻率與僅給予結(jié)腸刺激的IBS大鼠(D組)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示DCN異常電活動參與了IBS的內(nèi)臟敏化過程。

3 討 論

圖2 DC對IBS大鼠腸道ICC活化的影響(雙重?zé)晒饷庖呓M織化學(xué)法)Fig.2 Effect of DC on the activity of ICC in IBS rats (Double immunofluorescence histochemistry)

IBS的顯著特征是內(nèi)臟高敏感和胃腸道的異常運(yùn)動。有研究認(rèn)為，肥大細(xì)胞的活化會引起脫顆粒改變，造成組織胺的釋放，進(jìn)而引起炎性物質(zhì)或神經(jīng)活性物質(zhì)的改變[17-18]。新近研究表明，在IBS發(fā)生過程中，胃腸動力起搏及調(diào)節(jié)的腸道ICC在數(shù)量、超微結(jié)構(gòu)及功能方面均發(fā)生了明顯變化，并有新的、電活動異常的ICC再生，這種再生及原有變異的ICC可產(chǎn)生不規(guī)律的異常電生理活動[2]。更為重要的是，異常電活動可以通過ICC與胃腸神經(jīng)叢形成突觸樣聯(lián)系，傳遞給支配相應(yīng)胃腸運(yùn)動的中樞神經(jīng)核團(tuán)[19]。

本研究結(jié)果顯示，給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑DC以及給予IBS大鼠結(jié)腸擴(kuò)張刺激后，大鼠腹直肌肌電活動及DCN的放電頻率均呈現(xiàn)明顯變化，與給予ICC抑制劑的大鼠比較明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示在IBS的內(nèi)臟敏化和胃腸異常運(yùn)動方面，ICC的異常改變及其電生理活動變化所產(chǎn)生的結(jié)果明顯強(qiáng)于以往認(rèn)為的肥大細(xì)胞的作用，這與Brijs等[20]的研究結(jié)果類似。同時，本研究從形態(tài)學(xué)上證實(shí)IBS大鼠胃腸道ICC發(fā)生了明顯增殖，這可能是IBS內(nèi)臟敏化的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。此外，本研究通過電生理實(shí)驗(yàn)證實(shí)ICC產(chǎn)生的異常興奮電信號可以上傳至骶髓DCN，導(dǎo)致DCN敏化而過度興奮，過度興奮的DCN進(jìn)一步將異常電信號上傳至大腦皮層引發(fā)腹痛或者下傳至腹部靶器官，進(jìn)而加重其所支配的胃腸道運(yùn)動功能產(chǎn)生異常。

本研究所關(guān)注的ICC是介于胃腸神經(jīng)-平滑肌之間，自身存在自發(fā)性節(jié)律電活動并可將這種自發(fā)性節(jié)律電活動以放大方式傳播至受其支配的平滑肌，從而引發(fā)平滑肌收縮的關(guān)鍵細(xì)胞，各種胃腸調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)通過調(diào)節(jié)ICC節(jié)律放電的產(chǎn)生及傳播而對胃腸平滑肌的蠕動節(jié)律和動力進(jìn)行調(diào)節(jié)，表明ICC在胃腸動力以及順序蠕動調(diào)控中處于關(guān)鍵性地位。Wang等[21]在旋毛蟲誘導(dǎo)的IBS動物模型中發(fā)現(xiàn)，感染初期，ICC突起發(fā)生斑片狀破壞，同時發(fā)生胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少、中間絲網(wǎng)絡(luò)和細(xì)肌絲丟失等超微結(jié)構(gòu)變化，并有新的ICC再生，使ICC與平滑肌和腸道局部神經(jīng)元之間的聯(lián)系中斷，功能上表現(xiàn)為ICC電活動異常，并失去電活動的同步性，出現(xiàn)多個異位起搏點(diǎn)，造成電失偶聯(lián)的發(fā)生，以及局部慢波頻率的紊亂。另外，損傷后的ICC可以再生，而再生后的ICC形態(tài)與正常ICC不同，尤其是對刺激的反應(yīng)閾值明顯降低，電活動出現(xiàn)明顯異常，預(yù)示IBS可導(dǎo)致ICC出現(xiàn)敏化反應(yīng)，發(fā)生IBS時ICC的病理改變是導(dǎo)致胃腸功能紊亂和內(nèi)臟感覺異常最直接的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)等方法證實(shí)ICC在IBS內(nèi)臟敏化中起主導(dǎo)作用，而肥大細(xì)胞并未起到關(guān)鍵作用，這為IBS的臨床治療提供了新的思路，并為進(jìn)一步研究IBS內(nèi)臟敏化的分子機(jī)制指明了新的方向，有助于進(jìn)一步全面理解IBS發(fā)病機(jī)制以及新型藥物的研發(fā)過程。