龐亞琴 ，任彩婷 ，徐秋曼

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

重金屬鎘在作物體內(nèi)積累會(huì)產(chǎn)生毒害作用，嚴(yán)重阻礙其生長發(fā)育，進(jìn)而影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1].因此，如何緩解植物鎘脅迫一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).Wang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸能夠通過NO信號(hào)通路介導(dǎo)小麥幼苗對鎘脅迫的耐受性，促進(jìn)根的生長并維持活性氧平衡和降低Cd吸收；Basalah等[3]發(fā)現(xiàn)NO和水楊酸能夠通過誘導(dǎo)抗氧化酶活性和促進(jìn)保護(hù)劑脯氨酸的積累，保持植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡、減少丙二醛（MDA）積累和光合色素的變化，減緩Cd脅迫對植物的毒害；宋敏等[4]發(fā)現(xiàn)，外源施加脯氨酸能夠使遭受鎘脅迫小麥幼苗的根長、株高、干重、葉綠素和類胡蘿卜素含量恢復(fù)到對照水平，抗壞血酸、內(nèi)源游離脯氨酸含量和SOD活性上升，鎘積累量下降.微生物制劑也能夠緩解植物重金屬脅迫.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的植物根際促生菌（PGPR），PGPR是一類定殖于植物根系、能夠促進(jìn)植物生長和抵抗脅迫的益生細(xì)菌.解淀粉芽孢桿菌在生長過程中可產(chǎn)生具有廣泛抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝產(chǎn)物，目前關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的研究多圍繞這一內(nèi)容進(jìn)行[5].關(guān)于解淀粉芽孢桿菌對植物生長的促進(jìn)作用也有少量報(bào)道：如劉拴成等[6]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌可以提高玉米生長和產(chǎn)量；楊曉云等[7]研究表明，解淀粉芽孢桿菌能夠增加番茄植株的葉綠素和胡蘿卜素含量并增強(qiáng)根系活力.

小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物之一，土壤重金屬污染嚴(yán)重威脅了小麥農(nóng)業(yè)生產(chǎn).陳淋[8]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌能夠通過調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)促進(jìn)植物對鹽脅迫的耐受能力，如葉綠素、光合速率、脫落酸、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶等.本研究以小麥幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，將不同量的解淀粉芽孢桿菌HM618菌株發(fā)酵液作用于鎘脅迫下的小麥幼苗，分析其生長和生理指標(biāo)的變化，探討解淀粉芽孢桿菌緩解小麥物重金屬鎘脅迫的效應(yīng)，為深入探究解淀粉芽孢桿菌對植物重金屬脅迫緩解效應(yīng)的生理和分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌HM618（Bacillusamyloliquefaciens HM618，CGMCC7097），由天津大學(xué)化工學(xué)院程景勝課題組提供.

1.1.2 植物材料

小麥（Triticum aestivum L.）為“魯麥 22種子”，由天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 處理液配制和幼苗培養(yǎng)

1.2.1 處理液配制

分別取500 mL不同質(zhì)量濃度的CdCl2與不同體積的解淀粉芽孢桿菌HM618發(fā)酵液配制成12個(gè)處理組.處理組A1～A4的配方：CdCl2的質(zhì)量濃度為0 mg/L，HM618發(fā)酵液的體積分別為0、10、20、40mL；處理組B1～B4的配方：CdCl2的質(zhì)量濃度為20 mg/L，HM618發(fā)酵液的體積分別為0、10、20、40mL；處理組C1～C4的配方：CdCl2的質(zhì)量濃度為80 mg/L，HM618發(fā)酵液的體積分別為0、10、20、40 mL.

1.2.2 幼苗培養(yǎng)及處理

將小麥種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，沖洗3～5次后再用蒸餾水浸種12 h.將預(yù)處理的種子腹溝向下，整齊排列在直徑為12 cm、墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿40粒種子避光，蒸餾水培養(yǎng).待幼苗長至一葉一心時(shí)，分別用1.2.1中的處理液進(jìn)行處理，每個(gè)處理重復(fù)2次.

1.3 測定

1.3.1 生長指標(biāo)

培養(yǎng)5 d后，每個(gè)處理組隨機(jī)選取10株幼苗，測量根長和株高.

1.3.2 生理指標(biāo)

用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液提取葉綠素，采用紫外分光光度法[9]測定含量；采用考馬斯亮藍(lán)法[10]測定可溶性蛋白含量；采用蒽酮法[11]測定可溶性糖含量；采用酸性茚三酮法[12]測定游離脯氨酸含量；采用硫代巴比妥酸法[13]測定丙二醛含量.測定時(shí)每種處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Excel2003軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 HM618對鎘脅迫下小麥幼苗生長的影響

用12種處理液培養(yǎng)小麥幼苗5 d后，測量其生長指標(biāo)，結(jié)果如表1所示.由表1可以看出，隨著CdCl2處理濃度的增加，小麥幼苗的根長和株高均顯著降低，即CdCl2脅迫抑制了小麥幼苗的生長.在沒有鎘脅迫的情況下（A1～A4），HM618發(fā)酵液能夠顯著促進(jìn)株高（P＜0.05），對根長沒有促進(jìn)作用.在20mg/L CdCl2脅迫下，同不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗，根長分別增加了1.12%、8.50%和15.46%，株高分別增加了1.93%、24.18%和18.86%.在80 mg/L CdCl2脅迫下，與不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40 mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗，根長分別增加了24.57%、39.31%和43.24%，株高分別增加了14.86%、20.42%和28.19%.由此可見，鎘脅迫越嚴(yán)重，解淀粉芽孢桿菌HM618發(fā)酵液對小麥幼苗受毒害的緩解效果越明顯，尤其是對于根部生長的促進(jìn)作用效果顯著.

表1 不同處理組中小麥幼苗的根長和株高Tab.1 Root length and plant height of wheat seedlings in different groups cm

2.2 HM618對鎘脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素含量能夠直接反映出植物光合作用強(qiáng)度.測量不同處理組中小麥幼苗的葉綠素含量，結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同處理組中小麥幼苗的葉綠素含量Fig.1 Content of chlorophyll in wheat seedlings in different groups

由圖1可以看出，隨著CdCl2脅迫濃度的增加，小麥幼苗葉綠素含量逐漸降低（P＜0.05），即CdCl2脅迫會(huì)抑制葉綠素合成.在沒有鎘脅迫的情況下，對小麥幼苗單獨(dú)施加解淀粉芽孢桿菌時(shí)，葉綠素含量有輕微增加（P＞0.05）.在20 mg/L CdCl2脅迫下，與不用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液處理相比，用10、20、40 mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗，葉綠素含量分別增加了8.04%、16.30%和 22.47%（P＜0.05）.在80 mg/L CdCl2脅迫下，與不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40 mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗，葉綠素含量分別增加了10.05%、16.33%和30.03%.由此可見，解淀粉芽孢桿菌對鎘脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的降低有緩解作用，且發(fā)酵液越多效果越好.

2.3 HM618對鎘脅迫下小麥幼苗可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì).測量不同處理組中小麥幼苗的可溶性蛋白含量，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同處理組中小麥幼苗的可溶性蛋白含量Fig.2 Content of soluble protein in wheat seedlings in different groups

由圖2可以看出，隨著CdCl2脅迫濃度的增加，小麥幼苗葉片可溶性蛋白含量逐漸降低（P＜0.05）.在沒有鎘脅迫的情況下，用HM618發(fā)酵液處理小麥幼苗時(shí)，葉片可溶性蛋白的含量會(huì)顯著降低（P＜0.05）.與不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40 mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗時(shí)，20 mg/L CdCl2脅迫組中葉片可溶性蛋白含量分別增加了13.15%、16.59%和40.17%（P＜0.05）；80 mg/L CdCl2脅迫組中葉片可溶性蛋白含量分別增加了7.48%、15.62%和17.81%.由此可見，解淀粉芽孢桿菌對鎘脅迫下小麥幼苗葉片可溶性蛋白含量的減少有緩解作用.

2.4 HM618對鎘脅迫下小麥幼苗可溶性糖含量的影響

可溶性糖能夠?yàn)橹参锷L發(fā)育提供能量和代謝中間產(chǎn)物，同時(shí)具有信號(hào)功能參與代謝調(diào)控.測量不同處理組中小麥幼苗的可溶性糖含量，結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同處理組中小麥幼苗的可溶性糖含量Fig.3 Content of soluble sugar in wheat seedlings in different groups

由圖3可以看出，隨著CdCl2脅迫濃度的增加，小麥幼苗葉片可溶性糖含量逐漸增加，這可能是因?yàn)殒k脅迫刺激下植物啟動(dòng)了自身的保護(hù)系統(tǒng).鎘脅迫處理下，施加10 mL的HM618發(fā)酵液使小麥幼苗的可溶性糖含量略有降低（P＞0.05）.發(fā)酵液施加量為20 mL和40 mL時(shí)，可溶性糖含量顯著降低（P＜0.05），2種施加量的效果相近，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.由此可見，解淀粉芽孢桿菌對鎘脅迫下小麥幼苗葉片可溶性糖含量的增加有緩解作用.

2.5 HM618對鎘脅迫下小麥幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物體內(nèi)重要和有效的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在一定程度上反映了植物體內(nèi)的水分狀況和抗逆性.測量不同處理組中小麥幼苗的脯氨酸糖含量，結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同處理組中小麥幼苗的脯氨酸含量Fig.4 Content of proline in wheat seedlings in different groups

由圖4可以看出，隨著CdCl2脅迫程度的增加，小麥幼苗葉片中的脯氨酸含量逐漸增加，即CdCl2激發(fā)了小麥幼苗的抗逆機(jī)能.用HM618發(fā)酵液處理后，小麥幼苗葉片中的脯氨酸含量顯著降低，尤其是用20 mL和40 mL的發(fā)酵液處理，脯氨酸含量顯著降低.由此認(rèn)為，解淀粉芽孢桿菌對鎘脅迫下小麥脯氨酸含量的增加有緩解作用.

2.6HM618對鎘脅迫下小麥幼苗MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此可通過測定MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接判斷膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性.測量不同處理組中小麥幼苗的MDA含量，結(jié)果如圖5所示.

由圖5可以看出，隨著CdCl2脅迫濃度的增加，小麥幼苗葉片MDA含量逐漸增加，并且各處理組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.由此可見CdCl2脅迫會(huì)促進(jìn)小麥幼苗葉片MDA的積累.無鎘脅迫時(shí)，HM618發(fā)酵液對小麥幼苗葉片MDA含量作用不明顯.與不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗時(shí)，20 mg/L CdCl2脅迫處理組中，葉片MDA含量分別降低了3.39%，8.81%和12.10%（P＜0.05）；在80 mg/L CdCl2脅迫處理組中，葉片MDA含量分別降低了6.46%、11.96%和15.69%.由此可見，解淀粉芽孢桿菌對鎘脅迫下小麥幼苗葉片MDA含量的增加有緩解作用，且施加量越大效果越好.

圖5 不同處理組中小麥幼苗的MDA含量Fig.5 Content of MDA in wheet seedlings in different groups

3 討論與結(jié)論

本課題組研究了解淀粉芽孢桿菌HM618對小麥幼苗鎘脅迫的緩解作用.小麥幼苗在遭受到鎘脅迫時(shí)，根長和株高均顯著降低，葉片內(nèi)的葉綠素和可溶性蛋白含量降低，可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量增加.葉綠素含量是植物光合作用的重要指標(biāo)[14]，鎘脅迫會(huì)干擾植物體內(nèi)Fe的代謝以及對Mn、Zn、Mg等礦質(zhì)元素的吸收，從而使葉綠素含量下降.可溶性蛋白可作為酶參與植物體內(nèi)各種代謝，是植物在逆境中重要的生理指標(biāo).鎘脅迫程度較小時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)合成一些蛋白質(zhì)來提高抗性；鎘脅迫程度較大時(shí)，植物體內(nèi)的防御體系會(huì)受到損傷，蛋白質(zhì)合成受到抑制[15].可溶性糖不僅是植物的主要營養(yǎng)物質(zhì)，還是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì).植物遭受逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)可溶性糖含量增加，對細(xì)胞膜、原生質(zhì)體和酶類有一定的保護(hù)作用[16].幾乎所有逆境都會(huì)造成植物體內(nèi)脯氨酸的積累，脯氨酸在抗逆中有2個(gè)作用：一方面，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)防止水分散失；另一方面，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性.鎘脅迫會(huì)影響植物體內(nèi)多種酶的活性，使金屬硫蛋白和植物螯合肽的合成增加，從而促進(jìn)脅迫蛋白和游離氨基酸的積累[17].植物在逆境受到損傷后，體內(nèi)會(huì)積累過多的活性氧，產(chǎn)生膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛[18-19].鎘脅迫使植物體內(nèi)產(chǎn)生自由基，發(fā)生膜脂過氧化作用，從而使MDA含量顯著增加[20].

對鎘脅迫下的小麥幼苗施加解淀粉芽孢桿菌HM618發(fā)酵液后，葉片中葉綠素含量和可溶性蛋白含量顯著增加，可溶性糖、脯氨酸和MDA含量下降.陳淋[8]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌能夠提高鹽脅迫下玉米和擬南芥的葉綠素含量，從而提高光合作用能力，這一點(diǎn)與本研究結(jié)果相同.本研究中解淀粉芽孢桿菌會(huì)降低鎘脅迫下小麥幼苗的脯氨酸和可溶性糖含量，這可能是由于小麥幼苗遭受輕度鎘脅迫時(shí)能夠調(diào)動(dòng)自身抗性，增加脯氨酸和可溶性糖的合成，以抵御鎘脅迫的影響.當(dāng)施加解淀粉芽孢桿菌時(shí)，小麥幼苗的鎘脅迫得到緩解，使得脯氨酸和可溶性糖的合成降低，具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討.