周 穎， 宋 轉(zhuǎn)， 張俊梅， 劉文凱， 余 魁，吳夢郡， 趙 迪,2， 王 蕾 ,2*， 易 丹,2， 侯永清,2，

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430023；2.動(dòng)物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430023）

N-乙酰半胱氨酸（NAC）是左旋半胱氨酸以及谷胱甘肽合成的前體物質(zhì)，具備供給巰基的能力，能夠消除活性自由基以及減少細(xì)胞的凋亡、增進(jìn)生長，另外，還具有促進(jìn)組織抗藥、緩解毒物損傷等多種藥理效應(yīng)（Hou等，2015），臨床上應(yīng)用于呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)的病癥成效顯著，然而NAC對乙酸刺激仔豬腸黏膜屏障功能及腸黏膜生長的影響鮮見報(bào)道。

腸道黏膜屏障功能的損害主要是由炎癥引發(fā)腸道黏膜損傷導(dǎo)致的，研究表明免疫失調(diào)以及腸道炎性因子失衡，可破壞黏膜的滲透性、黏附性以及完整性（Rendon等，2013），從而損傷腸道屏障

功能，進(jìn)一步引發(fā)腸道炎性因子釋放失調(diào)、內(nèi)部菌群轉(zhuǎn)移，最終誘發(fā)相關(guān)機(jī)體器官衰竭（Bahloul等，2017）。本研究采用乙酸刺激仔豬腸黏膜是基于化學(xué)因素導(dǎo)致的腸道黏膜組織出現(xiàn)相應(yīng)的毀壞機(jī)制，病癥包含有腸黏膜彌漫性充血水腫，淋巴組織潰瘍，甚至出現(xiàn)部分黏膜缺失，造模簡單且穩(wěn)定（李亞歡等，2017），在此基礎(chǔ)上，進(jìn)而研究NAC對乙酸刺激仔豬小腸腸黏膜屏障功能及腸黏膜生長的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 NAC：市售醫(yī)藥級產(chǎn)品，純度不低于99.0%。乙酸（ACA）：國產(chǎn)分析純，純度≥98%。1.2 基礎(chǔ)日糧 試驗(yàn)采用玉米-豆粕型飼糧作為基礎(chǔ)飼糧，參照NRC（2012）營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，滿足仔豬的營養(yǎng)需要量。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成與營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用18頭（28±2）日齡、平均體重（5.79±1.17）kg“杜×長×大”三元雜交健康仔豬，隨機(jī)分為對照組、ACA組和NAC組。每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。仔豬預(yù)飼時(shí)間為7 d，其中前兩組飼喂基礎(chǔ)飼糧，第三組在飼喂基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加 0.05%的NAC。于正式試驗(yàn)第15天，對ACA組和NAC組仔豬直腸灌注10 mL濃度為10%乙酸溶液，對照組灌注相應(yīng)劑量的滅菌生理鹽水。第21天按仔豬每千克體重0.1 g由口腔灌入D-木糖溶液，1 h后從前腔靜脈采集血樣。然后采用戊巴比妥鈉進(jìn)行肌肉注射，其中肌注濃度按仔豬體重每千克50 mg，待深度麻醉后屠宰。取小腸黏膜樣品，存于-80℃待測。

1.4 飼養(yǎng)管理與屠宰 試驗(yàn)期間豬舍溫度保持22～25℃，并保證舍內(nèi)清潔。試驗(yàn)仔豬單體飼養(yǎng)，自由采食。于第21天屠宰收集樣品，采集距胃賁門大約5 cm處十二指腸，采集回腸、空腸中段樣品，所取腸段均為3 cm和10 cm的兩段相鄰腸段。3 cm腸段制作切片，10 cm腸段刮取腸黏膜，研磨，分裝，凍存于-80℃冰箱，待測。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 血漿D-木糖、EGF含量及血漿、小腸黏膜DAO活性的測定 血漿樣本中D-木糖水平檢測，采用間苯三酚比色法（張偉等，2011）。

取用腸黏膜0.5 g，冰浴勻漿，以3000 r/min離心15 min。采集上清液，使用放射免疫分析法檢測樣品中表皮生長因子（EGF）含量（方法靈敏程度：0.1 μg/mL，誤差：＜ 5%）。

血漿以及腸黏膜樣品中DAO活性的檢測參考張偉等（2011）的方法。

1.5.2 小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的測定 分別取十二指腸、空腸、回腸各約3 cm長，制作組織切片（冷煒博等，2014)，光鏡下測量絨毛高度、隱窩深度，以及絨毛表面積，根據(jù)結(jié)果計(jì)算絨毛高度/隱窩深度。

1.5.3 小腸黏膜 DNA含量、RNA/DNA、TP/DNA比值的測定 參考Sambrook（2006)測定小腸黏膜中DNA和RNA濃度，計(jì)算TP/DNA和RNA/DNA比值。

1.5.4 小腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平的測定 采用RT-PCR檢測腸黏膜EGF、EGFR和AR mRNA表達(dá)量，其中引物序列表2。

RNA樣品處理：使用Trizol法提取Total-RNA。在260 nm吸光度條件下檢測RNA純度以及濃度 （使用NanoDropRND-2000 UV-VIS核酸蛋白檢測儀），然后選擇吸光度260 nm與280 nm比值大于1.8的總RNA試驗(yàn)。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將 4 μL 5×PrimeScriptRbuffer、1 μL PrimeScriptRRT enzyme mix、1.0 μL RT primer mix、10 μL DNA eraser-treated RNA 和 4 μL RNase free water混合制成20 μL反應(yīng)體系，在37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，cDNA于-80℃保存。

PCR 反應(yīng)：20 μL 反應(yīng)體系中包含 10.0 μL SYBRRPremix Ex TaqTM（2×）、0.4 μL ROX reference dye II （10×）、2.0 μL cDNA、6.8 μL RNase free water、0.4 μL forward primer （10 μM）、0.4 μL reverse primer （10 μM）。 反應(yīng)條件為：95 ℃， 30 s；95℃，5 s和60℃，34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后做產(chǎn)物的熔解曲線分析，檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物的特異性。以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)被測基因與內(nèi)參基因的 Ct差值，使用 2-△△Ct法（Fu 等，2010）計(jì)算結(jié)果。1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)由Excel 2007整理后使用SPSS 23.0作統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較，處理結(jié)果中P＜0.05則判定為存在顯著性差異，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

表2 RT-PCR的引物序列

2 結(jié)果

2.1NAC對ACA刺激仔豬血漿D-木糖、EGF含量及血漿、腸黏膜DAO活性的影響 由表3可知，與對照組相比，ACA組血漿中EGF含量降低了8.13%，血漿DAO活性提高了94.80%（P＜0.05），十二指腸DAO活性提高17.95%（P＜0.05）；與ACA組相比，NAC組血漿D-木糖和EGF含量及十二指腸DAO活性提高了 17.29%、26.20%、21.35%（P＜0.05）；血漿 DAO 活性降低了13.35%（P ＜0.05）。

表3 仔豬血漿D-木糖含量及血漿、腸黏膜DAO活性

2.2 NAC對ACA刺激仔豬小腸黏膜形態(tài)的影響 由表4可知，相較于對照組仔豬，ACA組仔豬空腸絨毛高、十二指腸以及回腸絨毛高與隱窩深比值降低了14.03%、26.72%、14.97%，同時(shí)其十二指腸、空腸的絨毛表面積也下降了12.40%、37.11%（P＜0.05），十二指腸和回腸的隱窩深度分別提高了14.31%、8.14%（P＜0.05）；與ACA組相比，NAC組空腸絨毛高、十二指腸和回腸的絨毛高度/隱窩深度比值以及十二指腸和空腸絨毛表面積分別提升了 20.62%、29.41%、13.84%、41.23%、61%（P＜0.05），十二指腸和回腸的隱窩深度分別降低了7.79%、19.99%（P＜0.05）。

表4 仔豬小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)

乙酸灌腸對仔豬腸道形成刺激后，仔豬出現(xiàn)少動(dòng)、嗜睡、無食欲、稀便、血便等病癥，經(jīng)由光鏡觀察組織染色切片得出，對照組仔豬腸壁紋理清晰，上皮構(gòu)成完全，絨毛平整且體例規(guī)整，有正常的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)膜充血和炎性細(xì)胞浸潤，且小腸絨毛未出現(xiàn)萎縮以及壞死等現(xiàn)象。ACA組小腸絨毛表現(xiàn)出較多殘缺，小腸腸壁變薄，腺體變少，上皮細(xì)胞充血水腫，杯狀細(xì)胞縮減，炎性細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)出有差異的灶性糜爛，甚至出現(xiàn)部分組織脫落。此結(jié)果和高永利（2017）以及Ghalwash等（2017）的研究結(jié)果類似，NAC組仔豬腸黏膜形態(tài)構(gòu)造相較于ACA組有明顯提升。

2.3 NAC對ACA刺激仔豬腸黏膜細(xì)胞生長的影響 由表5可知，與對照組相比，ACA組回腸RNA/DNA比值和TP/DNA比值分別降低了38.91%和 26.35%（P＜0.05）；與 ACA組相比，NAC組十二指腸和空腸DNA含量、回腸RNA/DNA比值及十二指腸、空腸和回腸TP/DNA比值分別提高了 56.36%、13.51%、63.69%、17.29%、32.97%、34.03%（P ＜ 0.05）。

表5 仔豬小腸DNA含量、RNA/DNA、TP/DNA比值

2.4 NAC對ACA刺激仔豬小腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平的影響 由表6可知，與對照組相比，ACA對小腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平?jīng)]有顯著影響；與ACA組相比，NAC組回腸EGF mRNA水平提高了90.17%（P＜0.05）。

表6 仔豬小腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平

3 討論

3.1 NAC對ACA刺激仔豬血漿D-木糖含量及血漿、腸黏膜DAO活性的影響 仔豬口腔灌服D-木糖后，經(jīng)由小腸吸收，最后直接隨尿液排出，過程中不被動(dòng)物機(jī)體所利用，所以將D-木糖吸收量的測定作為腸道吸收能力常用的評定途徑 （楊彩梅等，2005)。本試驗(yàn)中，飼糧中添加NAC可以提高血漿D-木糖含量，說明NAC可以提高小腸吸收功能，這與Hou等（2012）研究結(jié)果一致，日糧中添加NAC可以提高磷酸脂多糖（LPS）刺激仔豬D-木糖含量。

DAO存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，其可參與腸道黏膜組織代謝，腸黏膜因各種原因受到損傷后導(dǎo)致胞內(nèi)DAO大量進(jìn)入血液。由此可見，血液中DAO含量能夠反映腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性 （劉飛飛等，2015）。研究表明，腸道絨毛的損傷能夠?qū)е卵褐蠨AO濃度上升，從而導(dǎo)致腸道組織活性下調(diào)，具體機(jī)理為腸道對自身應(yīng)激損傷進(jìn)行自我修復(fù)時(shí)DAO活性上升或下降（許文達(dá)等，2016）。本試驗(yàn)中，ACA組刺激提高了的血漿DAO活性，同時(shí)又降低了小腸中DAO活性，這表明乙酸刺激給仔豬腸黏膜造成了損傷。有報(bào)道指出，補(bǔ)充NAC可以緩解炎癥性腸病所引起的腸黏膜病癥如充血、水腫、潰瘍等，同時(shí)也可以抑制腸道細(xì)胞的凋亡（Hou 等，2015）。 楊晨等（2017）研究證明 NAC 能夠有效減輕黃疸病癥大鼠腸道屏障功能的損傷。本試驗(yàn)中NAC緩解了乙酸刺激所致的血漿DAO活性上升以及小腸黏膜DAO活性降低，說明NAC對腸道黏膜的損傷起到了一定的緩解作用。研究表明，NAC可以緩解磷酸脂多糖刺激所致的血漿DAO活性升高以及小腸黏膜DAO活性的降低（Hou 等，2012）。

3.2 NAC對ACA刺激仔豬小腸黏膜形態(tài)的影響 仔豬的腸道系統(tǒng)處于快速生長發(fā)育階段，腸道屏障功能的穩(wěn)定依靠完整的腸黏膜細(xì)胞來維持（晏利瓊等，2016）。小腸作為消化道內(nèi)重要的一部分，除了正常屏障功能外，還能吸收養(yǎng)分以及輸送養(yǎng)分至其他部位，所以腸道黏膜形態(tài)對其功能的體現(xiàn)尤為重要（王蕾等，2010）。仔豬腸道黏膜形態(tài)的評定主要根據(jù)其物理形態(tài)判定，判定主要指標(biāo)有絨毛高度、隱窩深度、絨毛表面積、絨毛高度與隱窩深度之比，小腸黏膜的形態(tài)表現(xiàn)出小腸消化吸收能力的高低（黃其春等，2014）。其中絨毛高度與細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)，隱窩具有分泌功能，其深淺反映了腸上皮細(xì)胞生成率，絨毛高度與隱窩深度的比值常用來表示上皮細(xì)胞的更新代謝程度（湯海鷗等，2014），比值降低表明動(dòng)物腸道黏膜受損，升高則表明黏膜細(xì)胞生長良好，功能改善。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示乙酸刺激降低了小腸的絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度的比值和絨毛表面積，說明乙酸刺激對小腸道黏膜造成了損傷，添加NAC后可有效緩解ACA刺激造成的這些負(fù)影響，表明NAC能夠在一定程度上增加腸上皮細(xì)胞的代謝替換速率，加快細(xì)胞生長，強(qiáng)化細(xì)胞自我恢復(fù)功能，使乙酸刺激引發(fā)的腸黏膜形態(tài)損傷得到緩解。

3.3 NAC對ACA刺激仔豬腸黏膜細(xì)胞生長以及腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平的影響腸道黏膜蛋白質(zhì)（TP）及其DNA對小腸細(xì)胞的生長和修復(fù)極其重要，單位組織中DNA含量的變化可以反映出細(xì)胞數(shù)量的多少（林謙等，2016），RNA與DNA的比值能夠準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)合成水平；TP/DNA比值可用來衡量細(xì)胞大小和蛋白質(zhì)沉積效率的高低 （Foley等，2016)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NAC補(bǔ)充能夠使乙酸刺激仔豬小腸DNA含量、RNA/DNA比值及TP/DNA比值上升，表現(xiàn)出NAC補(bǔ)充能夠緩解乙酸刺激所引發(fā)的生長抑制，其原因是由于過氧化物受到抑制而引發(fā)DNA斷裂以及因化學(xué)因素誘發(fā)的細(xì)胞轉(zhuǎn)變，令DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)，從而修復(fù)受損DNA。蛋白質(zhì)以及DNA含量上升說明腸細(xì)胞合成代謝加快（Groschwitz等，2009），于修善小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，NAC補(bǔ)充或許是經(jīng)由增進(jìn)腸黏膜蛋白合成途徑使得受損腸道得以修復(fù)。

表皮生長因子（EGF）是機(jī)體腸道受損后自我修復(fù)與再生的關(guān)鍵內(nèi)源調(diào)控因素之一，主要通過增進(jìn)細(xì)胞增殖從而加速損傷修復(fù) （劉淑杰等，2016）。表皮細(xì)胞生長因子受體（EGFR）作為受體酪氨酸激酶，與其結(jié)合的配體還有TGF-α、Amphiregulin （AR）、Epiregulin、HB-EGF 等 （劉淑杰等，2014），與EGF等配體結(jié)合后經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)，從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)。回腸EGF以及EGFR的mRNA水平在飼糧補(bǔ)充NAC以后得到顯著提升，其修復(fù)的機(jī)制或許是經(jīng)由EGF及其受體在組織中呈正向表達(dá)，進(jìn)一步激活酪氨酸激酶、蛋白G和磷酸脂酶C，進(jìn)而使鈣離子濃度變化，促進(jìn)糖酵解過程，增加損傷的自我修復(fù)與增殖再生，從而避免其向內(nèi)發(fā)展（劉淑杰等，2016）。與此同時(shí)，EGF能夠抑制細(xì)菌在黏膜遷移（吳秀群等，2011），加快與其相關(guān)的內(nèi)源性因素提升，加速上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷的愈合（胡瑩瑩等，2013）。研究表明EGF直腸灌注應(yīng)用到急性腸炎上成效顯著 （蘇鳳哲等，2015）。EGF家族中AR通過與EGFR結(jié)合激活EGFR信號通路，減少上皮細(xì)胞壞死，從而保證腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)齊整性（劉淑杰等，2016)，最終達(dá)到NAC補(bǔ)充后對腸道損傷修復(fù)與保護(hù)的效果。

4 結(jié)論

飼糧中添加0.05%的NAC可以在一定程度上緩解ACA刺激導(dǎo)致的小腸黏膜損傷，促進(jìn)腸黏膜生長，這可能與EGFR信號通路有關(guān)。