吳梅佳，黃 挺，米完完，應(yīng)園園，王航利，張夢(mèng)迪，黃繩武

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 311402；2.杭州紅十字會(huì)醫(yī)院普外科，浙江杭州 310003）

肺癌是世界上發(fā)病率最多和死亡率最高的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率和死亡率也占據(jù)首位，其中最常見的類型是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］。由于肺癌早期診斷過于困難，大多數(shù)患者就診時(shí)已到達(dá)中晚期。單純手術(shù)切除的效果有限，目前放化療、靶向治療和免疫治療是中晚期患者的主要治療方式。

鉑類藥物因其廣泛的抗癌譜和較強(qiáng)的抗腫瘤活性，一直是臨床上治療肺癌的重要藥物之一。在目前化療方案中，大部分需要用到鉑類藥物。除順鉑（cisplatin）以外，先后有卡鉑、奈達(dá)鉑和奧沙利鉑等鉑類藥物在多個(gè)國家上市。但鉑類藥物的耐藥性、無靶向性和不良反應(yīng)等大大地限制了其臨床應(yīng)用［2］。

近年來，麥角甾醇（ergosterol，ERG）抗癌作用的相關(guān)內(nèi)容陸續(xù)有報(bào)道。Yasukawa等［3］發(fā)現(xiàn)，ERG（從真姬菇中分離出的單體）對(duì)小鼠皮膚癌有很好的治療作用。近期，有研究篩選了13個(gè)對(duì)11種細(xì)胞系有抗癌活性的藥用菌，發(fā)現(xiàn)皺蓋假芝提取物對(duì)癌癥的抑制效果最好。對(duì)皺蓋假芝提取物分離純化，發(fā)現(xiàn)其中的單體ERG能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡［4］。Lin等［5］發(fā)現(xiàn)，ERG與兩性霉素B聯(lián)合治療，能夠有效地誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞壞死。ERG的抗肺癌作用迄今尚未見報(bào)道。

目前許多研究表明，癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥與誘導(dǎo)聚ADP-核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1）的表達(dá)變化密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，ERG過氧化物在體外能夠抑制PARP-1的活性［6］。因此推測(cè)，ERG可能具有增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞A549化療敏感性的功能。本研究通過體外培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞，采用MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)、Hoechst33258染色、流式細(xì)胞術(shù)和Western蛋白質(zhì)印跡等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活化胱天蛋白酶3和活化PARP-1蛋白表達(dá)，探討ERG在體外是否增加順鉑對(duì)A549細(xì)胞的敏感性，從而具有協(xié)同抗肺癌的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人NSCLC細(xì)胞A549購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，1676918）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司，1616966）；胰酶（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，15061103）；噻唑藍(lán)（MTT）試劑（美國Biosharp公司，B0016K012500）；二甲亞砜（DMSO）（美國Gibco公司，WXBB3106V）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，20150420）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、Hoechst33258凋亡染色試劑盒和細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Annexin V-PI流式凋亡試劑盒（美國BD公司，4293719）；兔抗鼠β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體，兔抗鼠活化胱天蛋白酶3多克隆抗體和兔抗鼠活化PARP-1多克隆抗體（美國ImmunoWay Biotechnology公司）；山羊抗兔IgG二抗（美國Rockland公司，C41217-04）；0.22 μm PVDF膜（美國Biosharp公司）；ERG對(duì)照品（含量95.5%，111845-201403），順鉑（中國食品藥品檢定研究院，含量99.8%，100401-201302）。

1.2 儀器

BCM-1000A生物潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；IX71熒光倒置顯微鏡和CX31光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；AG 22331離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；TU-100恒溫金屬?。ㄉ虾Ｒ缓憧萍加邢薰荆籓dyssey紅外激光雙色成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）；TS-1水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BS124S電子分析天平〔賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司〕；MS 3 digital渦旋混合器（德國IKA公司）；DK-450B電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；層析冷柜（德國Thermo公司）；VCX500超聲波破碎儀（美國SONICS公司）；TC20細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國Bio-Rad公司）；MLS-3750高壓滅菌鍋和MDF-U53V超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；MK3酶標(biāo)儀（德國Thermo公司）。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以5×107L-1密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80%去上清，加入ERG 15.75，31.5，63，126和252 μmol·L-1，順鉑16.75，33.5，67，134 和 268 μmol· L-1，ERG 15.75～252 μmol·L-1+順鉑 33.5 μmol·L-1各 100 μL，細(xì)胞對(duì)照組加入100 μL培養(yǎng)液。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別于加藥后12，24，48和72 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。每孔加入20 μL MTT溶液（5 g·L-1），37℃孵育4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO振蕩15 min，采用酶標(biāo)儀于492 nm處測(cè)定各孔吸光度（A492nm）值并計(jì)算抑制率。抑制率（%）=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組）×100%。采用SPSS軟件計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)下各個(gè)藥物的半數(shù)抑制率IC50值。采用q值判斷ERG和順鉑聯(lián)用的性質(zhì)。q=EAB/（EA+EB-EA×EB），式中EA和EB為各藥單用抑制率，EAB為兩藥合用抑制率。q＞1.15為協(xié)同作用，0.85～1.15為相加作用，＜0.85為拮抗作用。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力

選取作用24 h時(shí)間點(diǎn)下的ERG、順鉑和兩藥聯(lián)用組濃度，細(xì)胞分為4組：細(xì)胞對(duì)照組、ERG 31.5 μmol·L-1組、順鉑 33.5 μmol·L-1組和 ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑 33.5 μmol·L-1組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，以1.5×108L-1的細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80%。待細(xì)胞鋪滿，用PBS洗細(xì)胞3次。各組給藥以后，顯微鏡下拍照，記錄0 h時(shí)刻痕跡。放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照，記錄24 h時(shí)刻痕跡，計(jì)算劃痕寬度縮短率。劃痕寬度縮短率（%）=（1-24 h寬度/0 h寬度）×100%。

1.5 Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

藥物分組同1.4項(xiàng)所述。24 h后PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，吸出甲醛，PBS清洗3次，加入Hoechst33258染液，37℃染色30 min，滴入抗熒光淬滅劑后封片，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

1.6.1 細(xì)胞凋亡率測(cè)定

藥物分組同1.4項(xiàng)所述。24 h后收集上清及細(xì)胞，100×g離心5 min后棄去上清，預(yù)冷的PBS洗滌3次后用100 μL 1×流式緩沖液重懸，采用AnnexinⅤ-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡情況。每個(gè)給藥孔加入5 μL FITC與5 μL PI熒光染料，于室溫下黑暗處孵育15 min，每孔加入400 μL 1×緩沖液，用渦旋混合器低轉(zhuǎn)速下混合均勻，在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6.2 細(xì)胞周期測(cè)定

藥物分組同1.4項(xiàng)所述。藥物作用24 h后，收集上清及細(xì)胞，200×g離心10 min，PBS洗滌1次后，用75%乙醇固定過夜，離心棄掉乙醇，用PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于300 μL PBS中，加入PI，室溫避光染色30 min，置流式細(xì)胞儀上測(cè)定各周期細(xì)胞比例。

1.7 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)活化的胱天蛋白酶3和PARP-1蛋白表達(dá)

藥物分組同1.4項(xiàng)所述。24 h后收集上清及細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，調(diào)整各個(gè)樣品的上樣量一致，將蛋白質(zhì)樣品與2×上樣緩沖液以體積比1∶1混合后于100℃金屬浴中煮沸5 min，加入相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠，電泳至溴酚藍(lán)距離膠底部1 cm處即停止電泳，然后電轉(zhuǎn)移至0.22 μm的PVDF膜上，5%BSA封閉1 h，稍洗后分別加入適量活化胱天蛋白酶3（1∶500）、活化PARP-1（1∶1000）和β肌動(dòng)蛋白（1∶2000）一抗于4℃下孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入對(duì)應(yīng)來源的熒光二抗，常溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜并定量分析條帶的積分吸光值。以目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白的積分吸光度的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析法，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERG與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用

ERG 15.75～252 μmol·L-1和順鉑 16.75～268 μmol·L-1均能抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)且呈濃度依賴性。在不同藥物作用時(shí)間點(diǎn)下，ERG 15.75～252 μmol·L-1+順鉑 33.5 μmol·L-1各組對(duì) A549 細(xì)胞的抑制率相較于ERG 15.75～252 μmol·L-1及順鉑（33.5 μmol·L-1）單用組均有顯著提高（P＜0.05，P＜0.01），表明ERG與順鉑聯(lián)用明顯增強(qiáng)了順鉑對(duì)A549的敏感性（表1和表2）。順鉑單用組IC50值在24 h時(shí)為35.68 μmol·L-1，考慮到ERG作為一個(gè)中藥單體，與順鉑聯(lián)用的目的在于增效減毒，以期降低順鉑用量的同時(shí)，并不降低其藥效甚至達(dá)到更好的藥效。因此，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的兩藥聯(lián)用組中順鉑的濃度確定為 33.5 μmol·L-1。ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑33.5 μmol·L-1組在12，24，48和72 h，q值分別為1.04，1.16，1.05和0.97。表明ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑33.5μmol·L-1組在作用時(shí)間為24h時(shí)，具有協(xié)同作用。

Tab.1 Effect of ergosterol(ERG)combined with cisplatin on A549 cell viability

Tab.2 Effect of ERG combined with cisplatin on IC50at different time points

2.2 ERG與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1），細(xì)胞劃痕24 h后,各組劃痕寬度縮短率分別為（23±3）%，（20±5）%，（5±4）%和（41±6）%。與細(xì)胞對(duì)照組相比，ERG 31.5 μmol·L-1組和順鉑 33.5 μmol·L-1組的劃痕直徑縮短率明顯減?。≒＜0.01），ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑33.5 μmol·L-1組的劃痕直徑縮短率最小，細(xì)胞基本無遷移現(xiàn)象。表明兩藥聯(lián)用相較于藥物單用組，能極顯著減弱A549細(xì)胞的侵襲遷移能力。

Fig.1 Effect of ERG combined with cisplatin on migra?tion ability of A549 cells by inverted microscope.The cells were treated with drugs for 24 h.?:the width of scratching boundary.

2.3 ERG與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

2.3.1 Hoechst33258染色結(jié)果

Hoechst33258染色結(jié)果見圖2，在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞對(duì)照組的細(xì)胞發(fā)出較弱的藍(lán)色熒光，細(xì)胞核大小較均一，染色質(zhì)分布均一，無明顯的形態(tài)學(xué)改變；而實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)明顯改變，出現(xiàn)核濃染、碎裂，形狀不規(guī)則，大小不一，發(fā)出亮藍(lán)色熒光（圖中白色箭頭指向處）。ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑33.5 μmol·L-1組出現(xiàn)凋亡樣的細(xì)胞數(shù)量明顯多于二者單用組，表明兩藥聯(lián)用能有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

Fig.2 Effect of ERG combined with cisplatin on A549 cell apoptosis by inverted microscope.See Fig.1 for the treatment.Arrows show the apoptotic cells.

2.3.2 流式儀檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞凋亡情況結(jié)果如表3和圖3所示，單用順鉑組的細(xì)胞凋亡率在各個(gè)濃度下均要高于單用ERG組，而兩藥聯(lián)用組的凋亡率均顯著高于相同濃度下單用藥組（P＜0.01），且ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑33.5 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率最高，表明ERG和順鉑聯(lián)用能促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

Tab.3 Effect of ERG combined with cisplatin on A549 cell apoptosis by flow cytometry

Fig.3 Effect of ERG combined with cisplatin on A549 cell apoptosis by flow cytometry after 24 h treatment.

2.3.3 ERG與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

圖4結(jié)果表明，當(dāng)ERG濃度為31.5 μmol·L-1時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞周期產(chǎn)生明顯的G0/G1期阻滯，G0/G1期比例為（85.3±2.0）%，與細(xì)胞對(duì)照組（70.4±2.0）%相比明顯升高（P＜0.01）。而順鉑33.5 μmol·L-1可阻滯A549細(xì)胞周期于S期，比例為（41.5±2.5）%，與細(xì)胞對(duì)照組（12.7±0.9）%相比明顯升高（P＜0.01）。兩藥聯(lián)用時(shí)，A549細(xì)胞G2/M期比例增加為（20.0±1.5）%，與細(xì)胞對(duì)照組（15.8±1.3）%相比明顯升高（P＜0.05），表明兩藥聯(lián)用可能通過將A549細(xì)胞阻滯在G2/M期來抑制其增殖。

Fig.4 Effect of ERG combined with cisplatin on A549 cell cycle by flow cytometry.See Tab.3 for the treatment.

2.4 ERG與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的影響

實(shí)驗(yàn)得到蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0043X+0.0663，R2=0.9999，線性范圍為2.273～45.455 mg·L-1。Western蛋白質(zhì)印跡結(jié)果如圖5所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，ERG 31.5 μmol·L-1能夠顯著上調(diào) A549 細(xì)胞胞漿活化胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)（P＜0.05），而順鉑 33.5 μmol·L-1及 ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑33.5 μmol·L-1均能夠極顯著上調(diào)活化胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)（P＜0.01）；與單獨(dú)用藥組相比，二者聯(lián)合給藥后活化胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)與單一用藥組相比顯著上調(diào)（P＜0.01）。活化PARP-1蛋白的表達(dá)結(jié)果中，與細(xì)胞對(duì)照組相比可知，ERG 31.5 μmol·L-1不能引起A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白活化PARP-1蛋白表達(dá)的增加，而順鉑33.5 μmol·L-1及 ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑 33.5 μmol·L-1均能增加活化 PARP-1蛋白的表達(dá)（P＜0.01）；與順鉑33.5 μmol·L-1組相比，ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑33.5 μmol·L-1組給藥后活化PARP-1蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。ERG 31.5 μmol·L-1+順鉑33.5 μmol·L-1組執(zhí)行凋亡的活化胱天蛋白酶3和活化PARP-1蛋白明顯增多，表明兩藥聯(lián)用能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

Fig.5 Effect of ERG combined with cisplatin on protein expression of cleaved caspase 3（A，B）and cleaved poly ADP-ribose polymerase-1(PARP-1)（A，C）in A549 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B and C were the semi-quantitative result of A，respectively.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with ERG 31.5 μmol·L-1group；△△P＜0.01，compared with cisplatin 33.5 μmol·L-1group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，ERG的濃度在15.75～252 μmol·L-1，順鉑的濃度在16.75～268 μmol·L-1，ERG（15.75～33.5）μmol·L-1+順鉑33.5 μmol·L-1，對(duì)A549細(xì)胞有一定的增殖抑制作用，且呈較好的量效關(guān)系。ERG 31.5 μmol·L-1和順鉑 33.5 μmol·L-1聯(lián)合給藥具有協(xié)同作用。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ERG與順鉑聯(lián)用的凋亡率明顯高于ERG和順鉑單用。且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞早期凋亡率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。由于許多中藥成分會(huì)通過影響細(xì)胞周期來發(fā)揮抗癌作用［7-8］，本研究著重考察了ERG對(duì)A549細(xì)胞周期的影響。ERG 31.5 μmol·L-1能引起A549細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞增多和S期細(xì)胞的減少，順鉑 33.5 μmol·L-1單用能引起A549細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞減少和S期細(xì)胞的增多，ERG 31.5 μmol·L-1和順鉑 33.5 μmol·L-1聯(lián)合給藥能引起A549細(xì)胞G0/G1期、S期細(xì)胞減少和G2/M期細(xì)胞的增多，表明兩藥聯(lián)用可能通過導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯抑制其增殖，從而抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

已有研究報(bào)道，PARP-1作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡蛋白酶亞基，其參與的細(xì)胞死亡是通過從線粒體中釋放凋亡蛋白或消耗細(xì)胞質(zhì)中NAD+來實(shí)現(xiàn)的［9］。凋亡蛋白胱天蛋白酶7和胱天蛋白酶3在胱天蛋白酶斷裂位點(diǎn)（DEVD）將PARP-1切割成分子量為89和27 ku的2個(gè)片段［10］。PARP-1斷裂后，PARP-1不僅失去了催化活性［11］，而且使細(xì)胞內(nèi)能量不被耗盡，繼而保證細(xì)胞凋亡過程中的能量供應(yīng)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，ERG與順鉑聯(lián)合用藥能上調(diào)活化胱天蛋白酶3，活化PARP-1的表達(dá)也隨之增多，導(dǎo)致活化胱天蛋白酶3下游的PARP-1由于酶切作用而活性被抑制，可以推斷PARP-1的抑制可能是胱天蛋白酶信號(hào)通路中的一個(gè)普遍的機(jī)制。關(guān)于胱天蛋白酶介導(dǎo)的PARP-1活性抑制的作用，則是為了抑制后者對(duì)DNA片段化水解的順利進(jìn)行以及凋亡過程中的能量供給［13］。完整的胱天蛋白酶信號(hào)通路凋亡機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。ERG與順鉑聯(lián)用在其他肺癌細(xì)胞系上的增殖抑制作用研究，尚需進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，降低順鉑的用量，與ERG聯(lián)用可顯著抑制肺癌A549細(xì)胞增殖及遷移，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。從腫瘤化療角度看，藥物聯(lián)用對(duì)于降低抗腫瘤藥物毒性具有重要的臨床意義，這一結(jié)果為指導(dǎo)臨床用藥提供了一定的參考。