段冷昕，高 楊，胡 舉，趙亞飛，吳欣芳，王建剛

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng) 471023）

二至丸出自明·王三才的《醫(yī)便》，由女貞子（酒蒸）和墨旱蓮2味中藥等量（1∶1）制成。二至丸具有益肝腎、補(bǔ)陰血、壯筋骨、烏須發(fā)的功效，是平肝補(bǔ)腎的經(jīng)典方劑［1］?，F(xiàn)代研究表明，二至丸具有保肝、抗纖維化、增強(qiáng)免疫力、降血脂、改善缺鐵性貧血、抗骨質(zhì)疏松以及抗腫瘤等多種藥理活性［2］。

四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）是目前最為常用的誘導(dǎo)急性肝損傷的藥物，作用機(jī)制十分復(fù)雜。CCl4能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生大量的活性氧類（reactive oxygen species，ROS），ROS能夠引起細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的過(guò)氧化，進(jìn)而損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［3-4］。因此，CCl4誘導(dǎo)的肝損傷和ERS密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，二至丸的乙酸乙酯提取部分及醇提物均能顯著改善急性肝損傷模型小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transferase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transferase，GOT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等指標(biāo)［5-6］，表明二至丸提取物對(duì)小鼠肝損傷有一定的預(yù)保護(hù)作用，但目前有關(guān)二至丸保肝作用機(jī)制的深入研究報(bào)道較少。本研究旨在探討二至丸對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的預(yù)防作用及可能的分子機(jī)制，為二至丸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

女貞子和墨旱蓮均購(gòu)自北京同仁堂；二至丸參照文獻(xiàn)［7］制得：女貞子（蒸）500 g，墨旱蓮500 g，將女貞子粉碎成細(xì)粉，墨旱蓮加水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至適量，加煉蜜60 g及水適量，與上述粉末泛丸，干燥，即得。出膏率約為42%。GPT、GOT、MDA、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）和SOD試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司；兔抗鼠IgG-免疫組化試劑盒購(gòu)自博士德生物工程有限公司；兔抗鼠葡糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）多抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗鼠CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homolo?gous protein，CHOP）多抗、兔抗鼠β肌動(dòng)蛋白多抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司；CCl4購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

TGL-16G高速冷凍離心機(jī)（上海安寧科學(xué)儀器廠）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad）；電子分析天平（美國(guó)Mettler-Toledo公司）；Leica RM2128切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；Motic生物顯微鏡B310-T（中國(guó)廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；SHY-2水浴恒溫振蕩器（中國(guó)金壇市迅生儀器廠）。

1.2 動(dòng)物、分組和處理

50只清潔級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2010-0007，飼養(yǎng)溫度18～22℃，光照12 h，相對(duì)濕度50%～60%，自由攝食飲水。

小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和二至丸1.4，2.8和5.6 g·kg-1組（ig，每天1次，連續(xù)14 d），正常對(duì)照組和模型組以同樣方式給予生理鹽水。末次給藥8 h后，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠ip給予10%CCl4溶液10 mL·kg-1（用豆油稀釋）［8］，24 h后摘除眼球取血，而后處死小鼠，取肝和脾進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

摘除眼球取血后，825×g離心10min制備血清，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定GPT，GOT，SOD，MDA和GPX。

1.4 臟器指數(shù)計(jì)算

稱取肝、脾質(zhì)量和體質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.5 HE染色觀察肝組織病理變化

取小鼠肝左葉部位［9］，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，制成5 μm切片后進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。

1.6 TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將肝組織切片依次脫蠟，水化，蛋白酶K 37℃通透30 min，PBS漂洗3次，加TUNEL反應(yīng)混合液（TdT：熒光素標(biāo)記的dUTP=1∶9）進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，37℃恒溫箱孵育30 min后進(jìn)行DAB顯色，脫水，透明，封片。以細(xì)胞核呈棕褐色為凋亡細(xì)胞陽(yáng)性染色。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 免疫組化法檢測(cè)CHOP和GRP78蛋白表達(dá)

將組織切片經(jīng)脫蠟，水化，抗原熱修復(fù)后，以5%BSA 37℃ 封 閉 30 min，加 一 抗（GRP78：1∶250；CHOP：1∶50）4℃過(guò)夜，PBS清洗3次，每次5 min，加二抗37℃孵育30 min，PBS清洗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染45 s，脫水，透明，封片，拍照。利用Image Pro Plus6.0軟件分析其吸光度比值。

1.8 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CHOP和GRP78水平

取肝組織100 mg，加入RIPA裂解液1 mL，于冰上研磨裂解后離心得肝總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取蛋白樣品80 μg進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜（200 mA，120 min），5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加一抗 4℃過(guò)夜（CHOP：1∶500；GRP78：1∶1000；β肌動(dòng)蛋白：1∶5000），TBST洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1000），37℃孵育1 h，ECL發(fā)光顯色，采用Gel-Pro Analyzer分析蛋白條帶積分吸光度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度的比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二至丸對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠血清GPT，GOT，SOD和GPX活性及MDA含量的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中GPT和GOT活性及MDA含量顯著升高（P＜0.01），SOD和GPX活性顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，二至丸各劑量組小鼠血清中GPT和GOT活性及MDA含量均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD和GPX活性顯著升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性（r=0.83，P＜0.05）。

Tab.1 Effect of Erzhi pill on content of malondialdehyde（MDA）and activity of glutamic-oxaloacetic transferase（GOT），glutamic-pyruvic transferase（GPT），superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GPX）in serum of mice with carbon tetrachloride（CCl4）-induced acute liver injury

2.2 二至丸對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝指數(shù)和脾指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組肝指數(shù)明顯增加（P＜0.01），脾指數(shù)顯著減?。≒＜0.01）；與模型組相比，二至丸各劑量組肝和脾系數(shù)有不同程度改善，其中2.8和5.6 g·kg-1組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

Tab.2 Effect of Erzhi pill on index of liver and spleen of mice with CCl4-induced acute liver injury

2.3 二至丸對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞索排列規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞無(wú)壞死、變性，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常對(duì)照組相比，模型組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，胞質(zhì)疏松，出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及片狀壞死和氣球樣變。與模型組相比，二至丸1.4，2.8和5.6 g·kg-1組小鼠肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)不同程度減輕（圖1）。

2.4 二至丸對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

Fig.1 Effect of Erzhi pill on histopathological changes of hepatocytes in mice with CCl4-induced acute liver injury by HE staining.See Tab.1 for the mouse treatment.The arrows show lesion locations.

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，二至丸各劑量組肝細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈劑量依賴性（r=0.99，P＜0.01）（圖2）。

2.5 二至丸對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織GRP78和CHOP表達(dá)的影響

免疫組化（圖3和4）和Western蛋白質(zhì)印跡結(jié)果（圖5）顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝細(xì)胞中CHOP和GRP78的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，二至丸1.4，2.8和5.6 g·kg-1組CHOP表達(dá)顯著下降（P＜0.01），二至丸2.8和5.6 g·kg-1組GRP78表達(dá)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），1.4 g·kg-1組GRP78表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.2 Effect of Erzhi pill on apoptosis of hepatocytes in mices with CCl4-induced acute liver injury by TUNEL assay.See Tab.1 for the mouse treatment.The apoptosis rate（%）=the number of apoptotic cells/the total number of cells×100%.B was the semi-quantitative result of A.±s,n=10.＊＊P＜0.01,compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01,compared with model group.

Fig.3 Effect of Erzhi pill on expression of CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein(CHOP)in hepatocytes of mice with CCl4-induced acute liver injury by immunohistochemical assay.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s,n=10.＊＊P＜0.01,compared with normal control group；##P＜0.01,compared with model group.

Fig.4 Effect of Erzhi pill on expression of glucose regulated protein 78(GRP78)in hepatocytes of mice with CCl4-induced acute liver injury by immunohistochemical assay.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s,n=10.＊＊P＜0.01,compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01,compared with model group.

Fig.5 Effect of Erzhi pill on expression of CHOP(A,B)and GRP78(A,C)in hepatocytes of mice with CCl4-induced acute liver injury by Western blotting.See Tab.1 for the mouse treatment.B and C were the semi-quantita?tive results of A.±s,n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01,compared with model group.

3 討論

CCl4在肝內(nèi)經(jīng)微粒體細(xì)胞色素P450分解活化，生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基，導(dǎo)致肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性增高，血清中GPT和GPT活性顯著升高，因此GPT和GOT活性常被用來(lái)作為檢測(cè)急性肝損傷的指標(biāo)［10］。GPX和SOD可以減輕和消除氧化損傷，清除自由基，是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)［11］。MDA是反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度和氧化應(yīng)激情況的重要生物指標(biāo)之一。閆冰等［12-14］研究發(fā)現(xiàn)，采用二至丸不同的保肝活性組分預(yù)保護(hù)給藥后，腹腔注射CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，二至丸不同的保肝活性成分均能夠降低血清中GPT和GOT的活性，降低MDA的含量，增強(qiáng)SOD的活性。本研究中采用二至丸整方ig給藥，發(fā)現(xiàn)同樣可明顯降低血清中GPT和GOT活性及MDA含量，升高SOD和GPX活性，并呈劑量依賴性。HE染色結(jié)果表明，二至丸各劑量組的小鼠肝壞死程度隨著給藥劑量的增加逐漸減輕。由此可見(jiàn)，二至丸能減輕氧化應(yīng)激所致的小鼠肝損傷。

CCl4代謝產(chǎn)生大量的ROS能夠引起細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的過(guò)氧化，進(jìn)而損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致ERS［15］。在ERS發(fā)生的早期，細(xì)胞通過(guò)上調(diào)GRP78的表達(dá)、加速未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的降解、抑制蛋白質(zhì)合成等途徑緩解ERS，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，促進(jìn)細(xì)胞存活；過(guò)度劇烈或持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的ERS將激活下游相應(yīng)的凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而CHOP是ERS與細(xì)胞凋亡之間的重要信號(hào)分子，GRP78和CHOP表達(dá)水平的上升是ERS所致細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志之一［16-18］。本研究結(jié)果顯示，二至丸各給藥組劑量依賴性地降低CCl4所致肝細(xì)胞凋亡率；免疫組化和Western蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，二至丸各劑量組均能顯著逆轉(zhuǎn)CCl4致急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞CHOP蛋白的升高，二至丸5.6 g·kg-1組能顯著逆轉(zhuǎn)GRP78蛋白的升高，表明二至丸可通過(guò)抑制CHOP和GRP78的表達(dá)，減輕CCl4引起的ERS，減少細(xì)胞凋亡。

綜上，二至丸對(duì)CCl4所致的急性肝損傷具有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激和緩解ERS有關(guān)。本研究結(jié)果為深入研究二至丸的保肝作用及其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。