羅 超，祝春燕，潘雨萍，吳偉斌

（1.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，浙江紹興 312000；2.紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院綜合康復(fù)科，浙江紹興 312000；3.肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廣東肇慶 526020）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素引起的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，是肺部炎癥和通透性增加的綜合征，其嚴(yán)重惡化階段為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［1］。研究認(rèn)為，細(xì)菌感染導(dǎo)致的膿毒血癥及嚴(yán)重肺炎是ALI最常見的誘發(fā)因素［2］。在嚴(yán)重感染期，大量的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）被細(xì)菌釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，被細(xì)胞膜上相應(yīng)受體所識(shí)別，進(jìn)而攻擊靶細(xì)胞。人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human pulmonary microvascular endothelial cells，hPMEC）是肺氣血交換的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是肺部最早受到LPS攻擊的效應(yīng)細(xì)胞［3］。LPS的刺激一方面增加hPMEC細(xì)胞壁的通透性，引起肺部蛋白滲出及水腫；另一方面，LPS通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-8等炎癥細(xì)胞因子以及細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）等黏附分子，誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致肺組織的氧化損傷和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肺損傷的發(fā)展［4-5］。

半夏（Pinelliae Rhizoma）為天南星科植物半夏〔Pinellia ternata（Thunb.）Breit〕的干燥塊莖［6］。其生藥有毒，常以炮制品入藥，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之功效，是呼吸系統(tǒng)疾病的常用中藥。研究表明，半夏提取物及其經(jīng)典方劑在哮喘、急慢性支氣管炎等肺部炎癥性疾病中有著良好的治療效果［7-8］?？寡讓?shí)驗(yàn)研究顯示，半夏及其炮制品提取物能降低小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷時(shí)IL-6和TNF-α的表達(dá)，降低內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［9］。半夏多糖（polysaccharide from Pinelliae Rhizoma，PSPR）具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化的生物活性［10-11］，是半夏的主要活性部位之一。本研究以《中國(guó)藥典》收錄的3種半夏（姜半夏、法半夏和清半夏）炮制品為受試藥原料，提取PSPR，以LPS誘導(dǎo)的hPMEC為模型，研究PSPR對(duì)ALI早期hPMEC炎癥損傷的保護(hù)作用，為PSPR應(yīng)用于ALI治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

清半夏（產(chǎn)地：河南，批號(hào)160401）、姜半夏（產(chǎn)地：河南，批號(hào)160226）和法半夏（產(chǎn)地：湖北，批號(hào)160301）（河南張仲景大藥房）。經(jīng)肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系唐鐵鑫副教授鑒定為天南星科植物半夏的塊莖，符合《中國(guó)藥典》2015年版項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。

D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-201506）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；M131培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺、微血管細(xì)胞生長(zhǎng)因子（microvascular growth supplement，MVGS）和黏附因子（美國(guó)Gibco公司）；LPS（美國(guó)Sigma公司）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物）；TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光液（杭州弗德生物）；兔抗人IL-8多克隆抗體和兔抗人ICAM-1多克隆抗體（美國(guó)Affinity Biosciences公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Jackson ImmunoRe?search公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)DBI試劑）；Trizol和定量PCR檢測(cè)試劑盒（北京天根）；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮），生物倒置顯微鏡（日本Olympus），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific），熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI），微量核酸定量?jī)x（美國(guó)Merinton），電泳儀及轉(zhuǎn)移裝置（北京六一）。

1.2 PSPR的制備

半夏藥材60℃烘干至恒重，粉碎，精密稱取相同質(zhì)量的3種半夏炮制品，先后用石油醚、乙醇各浸漬6 h進(jìn)行脫脂，揮干溶劑，90℃熱水抽提3次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓蒸餾濃縮，向濃縮液中加入無水乙醇，至乙醇濃度達(dá)80%，4℃孵育24 h，離心收集沉淀，揮干，60℃熱水復(fù)溶后，Sevag法除蛋白，離心取上清，移入3500 U透析袋透析48 h，除去水溶性小分子，透析液加入乙醇沉淀，收集沉淀，分別用乙醇、丙酮和乙醚清洗3次，干燥收集總多糖［11］。以D-無水葡萄糖為對(duì)照品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定PSPR中糖含量［12］，紫外分光光度計(jì)490 nm檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=9.5424x+0.0124，R2=0.9999），計(jì)算得到3種PSPR中多糖含量分別為87.0%（法半夏）、85.3%（姜半夏）和89.6%（清半夏）。并根據(jù)提取率公式〔提取率（%）=多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%〕計(jì)算3種半夏炮制品飲片中多糖的含量分別為4.97%（法半夏）、14.83%（姜半夏）和11.21%（清半夏）。

1.3 細(xì)胞及分組

hHPMEC-ST1.6R［13］受贈(zèng)于德國(guó)美因茲大學(xué)病理研究所KIRKPATRICK教授；培養(yǎng)于含20%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol·L-1和5%MVGS的M131培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合度后進(jìn)行傳代，4～6 d傳代1次。

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑對(duì)照組，設(shè)LPS 1 mg·L-1作用24 h組和LPS+PSPR組（3種PSPR 100和400mg·L-1分別與LPS1mg·L-1同時(shí)加入，作用24h）。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活

調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L-1，加入96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后按1.3分組加藥處理，作用24 h后，每孔加入20 μL CCK-8試劑，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定吸光度（A450nm）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率（%）=（加藥組A450nm-空白組A450nm）/（對(duì)照組A450nm-空白組A450nm）×100%。

1.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF- α，IL-1 β，IL-6和IL-8含量

調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L-1，加入96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按1.3分組加藥處理，作用24 h，收集細(xì)胞上清液，采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8的含量，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀測(cè)定A450nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.6 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)IL-8和ICAM-1蛋白表達(dá)

按每孔1×106細(xì)胞接種12孔板，按1.3分組加藥處理24 h后，收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，以BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗人IL-8多抗、兔抗人ICAM-1多抗（1∶1000）4℃孵育過夜，洗膜后，室溫下加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5000）孵育30min，最后通過ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像，利用Image J軟件進(jìn)行蛋白相對(duì)積分吸光度分析，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，以目標(biāo)蛋白與β肌動(dòng)蛋白積分吸光度值比值表示IL-8和ICAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞IL-8和ICAM-1 mRNA水平

按每孔1×106細(xì)胞接種12孔板，按1.3分組加藥處理24 h后，收集各組細(xì)胞，以Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，在熒光定量PCR儀上用相應(yīng)的引物、cDNA等材料按步驟進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行基因表達(dá)分析。IL-8和ICAM-1對(duì)應(yīng)的PCR引物如表1所示。

Tab.1 Sequences of RT-PCR primers

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多樣本均數(shù)間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，組間的兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSPR對(duì)LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響

CCK-8結(jié)果（圖1）顯示，與溶劑對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與LPS組相比，3種PSPR 100和400 mg·L-1組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of three kinds of polysaccharides from Pinelliae Rhizoma（PSPR）on cell viability of human pulmonary microvascular endothelial cells（hPMECs）.PRP：Pinelliae Rhizoma Praeparatum；PRPZA：Pinelliae Rhizoma Praeparatum Cum Zingibere Et Alumine；PRPCA：Pinelliae Rhizoma Praeparatum Cum Alumine.Cells were pretreated with PSPR 100 and 400 mg·L-1and then with lipoapolysaccha?ride（LPS）1 mg·L-1for 24 h.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with LPS 1 mg·L-1 group.

2.2 PSPR對(duì)LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF- α，IL-1 β，IL-6和IL-8釋放的影響

與溶劑對(duì)照組相比，LPS 1 mg·L-1組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8含量升高（P＜0.01）（圖2），提示LPS作用導(dǎo)致hPMEC發(fā)生炎癥反應(yīng)，分泌炎癥因子。與LPS 1 mg·L-1組相比較，3種PSPR 100和400 mg·L-1組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8含量均降低（P＜0.01），提示3種PSPR在100和400 mg·L-1濃度對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPMEC炎癥損傷有起到保護(hù)作用。

Fig.2 Effect of PSPR on tumor necrosis factor- α（TNF-α），interleukin-1 β (IL-1 β)，IL-6 and IL-8 release from LPS-induced hPMECs.See Fig.1 for cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group；##P＜0.01，compared with LPS 1 mg·L-1group.

2.3 PSPR對(duì)LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-8和ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

Western蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示（圖3），與溶劑對(duì)照組相比，LPS刺激能促使hPMEC內(nèi)IL-8和ICAM-1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與LPS組相比，3種PSPR 100和400 mg·L-1組細(xì)胞IL-8和ICAM-1的表達(dá)均降低（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，3種PSPR在100和400 mg·L-1濃度下能夠有效降低LPS誘導(dǎo)的hPMEC中IL-8和ICAM-1表達(dá)升高。

2.4 PSPR對(duì)LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-8和ICAM-1 mRNA水平的影響

與溶劑對(duì)照組相比，LPS刺激導(dǎo)致hPMEC內(nèi)IL-8和ICAM-1 mRNA水平顯著升高（P＜0.01）（圖4）。與LPS 1 mg·L-1組相比，3種PSPR 100和400 mg·L-1組均可顯著降低細(xì)胞內(nèi)IL-8和ICAM-1 mRNA的水平，（P＜0.01）。提示3種PSPR在100和400 mg·L-1濃度對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPMEC IL-8和ICAM-1 mRNA水平具有一定的抑制作用。

Fig.4 Effect of PSPR on IL-8(A)and ICAM-1(B)mRNA level in hPMECs induced by LPS detected by RT-PCR.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，3種PSPR對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPMEC炎癥損傷有顯著的保護(hù)作用，抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α，IL-1β和IL-6釋放，并能從基因水平抑制IL-8和ICAM-1的表達(dá)。上述結(jié)果表明，PSPR可通過抑制TNF-α，IL-1β和IL-6等早期促炎因子的釋放而保護(hù)LPS損傷的hPMEC，緩解ALI早期hPMEC的損傷；此外，PSPR還可有效抑制IL-8和ICAM-1的表達(dá)，緩解IL-8和ICAM-1過表達(dá)而觸發(fā)的中性粒細(xì)胞趨化作用，減緩中性粒細(xì)胞聚集，延緩肺損傷的發(fā)展。

PMEC損傷和功能失調(diào)是ALI發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)［14］，LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，釋放大量促炎因子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或功能障礙，增加血管通透性，促進(jìn)循環(huán)中的炎癥細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮屏障向肺部聚集，進(jìn)而引起機(jī)體產(chǎn)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織的進(jìn)一步損傷［15-16］。TNF-α，IL-1β和IL-6是ALI早期發(fā)展過程中的主要促炎因子，這些因子不僅可直接導(dǎo)致肺損傷，還可激活其他信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致肺損傷［17］。TNF-α是炎癥的重要啟動(dòng)子，是ALI最先出現(xiàn)的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)IL-1，IL-6和IL-8等炎癥因子的分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，其分泌水平與肺部損傷程度呈正相關(guān)［18］。IL-1β是一種調(diào)節(jié)自然免疫的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)調(diào)控其他炎性因子在多種細(xì)胞中的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中起協(xié)同作用［19］。IL-6是啟動(dòng)全身炎癥反應(yīng)的最強(qiáng)內(nèi)源性炎癥因子，在ALI中，IL-6可直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管通透性增加［20］。3種PSPR均可通過抑制TNF-α，IL-1β和IL-6等促炎因子的釋放而緩解LPS誘導(dǎo)的hPMEC損傷，并有助于緩解促炎因子引起的進(jìn)一步炎癥級(jí)聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)和肺組織的進(jìn)一步損傷，達(dá)到減輕ALI炎癥損傷的效果。

中性粒細(xì)胞募集在ALI/ARDS的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，而IL-8和ICAM-1對(duì)中性粒細(xì)胞的激活及向肺組織聚集具有重要的影響。IL-8是體內(nèi)潛在的中性粒細(xì)胞趨化因子，研究顯示，ALI/ARDS患者存在IL-8表達(dá)升高的現(xiàn)象，抑制IL-8可有效緩解肺部炎癥和組織損傷［21］。除誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集外，IL-8還可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中性粒細(xì)胞β2黏附受體表達(dá)，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞間遷移，激活中性粒細(xì)胞［22］，進(jìn)一步導(dǎo)致肺組織的氧化損傷和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肺損傷的發(fā)展。ALI發(fā)病過程中，ICAM-1表達(dá)升高，與中性粒細(xì)胞表面的整合素相互作用，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞［23-24］。此外，ICAM-1還是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞參與肺損傷級(jí)聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，能促進(jìn)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用［25］，是預(yù)測(cè)ALI嚴(yán)重程度的指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，3種PSPR均可抑制LPS誘導(dǎo)的hPMEC內(nèi)IL-8和ICAM-1表達(dá)升高，具有抑制ALI中性粒細(xì)胞向肺組織聚集的潛在活性，可有效緩解因中性粒細(xì)胞激活和向肺組織聚集而引起的ALI病情進(jìn)一步加重。其上游機(jī)制一方面可能與抑制TNF-α等促炎因子的釋放相關(guān)，另一方面可能與NF-κB等通路對(duì)IL-8和ICAM-1 mRNA表達(dá)的調(diào)控相關(guān)。

天然產(chǎn)物防治ALI的應(yīng)用研究越來越受到關(guān)注，人參皂苷、丁香酚、丹參酮ⅡA、漢防己堿和黃芩苷等均表現(xiàn)出一定的防治ALI的活性，且可通過調(diào)節(jié)NF-κB和促分裂原活化的蛋白激酶等信號(hào)通路及Toll樣受體、過氧化物酶體增殖物激活受體γ和腺苷A2A受體等途徑，抑制炎癥反應(yīng)，改善屏障功能及減輕氧化應(yīng)激等ALI病理特征，顯示出廣闊的應(yīng)用前景［26］。半夏及其方劑在治療呼吸系統(tǒng)疾病方面有著悠久的歷史和顯著的療效，其抗炎和鎮(zhèn)咳的功效是其應(yīng)用于ALI防治研究的潛在基礎(chǔ)。多糖是天然產(chǎn)物抗炎活性的主要部位，PSPR成分復(fù)雜，主要由甘露糖、半乳糖糖羰酸、葡萄糖、半乳糖和樹膠醛醣（摩爾比 1.83∶0.55∶75.75∶1.94∶0.45）等組成［27］。 本研究結(jié)果顯示，3種PSPR對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPMEC損傷都有顯著的保護(hù)作用，其作用效果與丹參酮ⅡA和丁香酚等天然產(chǎn)物相近［28-29］。不同的炮制方法對(duì)半夏炮制品中多糖的含量影響較大，但對(duì)相同濃度的多糖的抗炎活性影響較小，3種PSPR抗炎活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究初步證實(shí)了PSPR對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPMEC炎癥損傷具有保護(hù)作用，抑制促炎因子的釋放，且能從基因水平抑制相關(guān)中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，預(yù)示著PSPR可以從急性炎癥的抑制和中性粒細(xì)胞聚集的調(diào)控2個(gè)方面有效緩解ALI的發(fā)展。其總多糖中確切的起效成分及其對(duì)上游通路的影響機(jī)制值得進(jìn)一步研究。