李維熙 ，劉冬麗，蘇薇薇，高永堅(jiān)*

（1. 云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；3. 國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305）

酸角（Tamarindus indicaLinn.），又名酸豆、羅望子，為蘇木科酸角屬植物，原產(chǎn)于非洲熱帶, 現(xiàn)在全世界熱帶、南亞熱帶地區(qū)均有廣泛引種和栽培[1]。我國(guó)云南、四川、海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等省均有大范圍種植。酸角在非洲、印度、孟加拉國(guó)、尼日利亞和巴基斯坦等國(guó)家作為傳統(tǒng)常用藥，使用歷史悠久[2]。在我國(guó)，酸角也被歷代醫(yī)藥典籍收載，據(jù)《本草綱目拾遺》記載“羅晃子味甘、性溫、止渴退熱，解利風(fēng)邪”，《滇南本草》中也有“酸角味甘、性平。治酒化疾，隔于胃中”的說(shuō)法。多項(xiàng)研究表明，酸角葉、果肉及種子提取物有較好的抗菌、抗真菌、退熱、止痛等活性[3]。目前，我國(guó)與酸角有關(guān)產(chǎn)品主要為普通飲料、糖果與糕點(diǎn)，開(kāi)發(fā)利用程度較低。酸角殼為酸角食用和加工中的廢棄物，資源豐富，成本低廉，如能加以利用，將有巨大的開(kāi)發(fā)潛質(zhì)。

本文通過(guò)脂肪負(fù)荷模型探討酸角殼提取物對(duì)脂肪吸收的影響，并評(píng)價(jià)酸角殼提取物對(duì)腸道脂肪酶活性的抑制作用，旨在為開(kāi)發(fā)酸角殼提供有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體重200～240 g，SPF級(jí)，7周齡，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（粵）2014-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照美國(guó)NIH要求在清潔級(jí)層流架中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～24 ℃，照明時(shí)間12 h/d（6:00～18:00開(kāi)燈）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與材料

橄欖油（美國(guó)Sigma公司）；豬胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；4-甲基傘形酮（4-MU，美國(guó)Sigma公司）；考馬斯亮藍(lán)試劑盒，甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒及游離膽固醇（free cholesterol, FC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器

MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystem公司）；Ultra-Turrax T8型組織勻漿機(jī)（德國(guó)IKA Labordchnik公司）；3-18K型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）；BS210S電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；WH-861型漩渦混合器（太倉(cāng)科教器材廠）；超純水儀（德國(guó)Merck Millipore公司）；pHS-25型酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠）；ZF-Ⅱ型紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）。

1.4 酸角殼提取物的制備

酸角采自云南西雙版納。準(zhǔn)確稱取一定量，粉碎機(jī)粉碎后回收細(xì)粉化的酸角殼，加入10倍量50 %乙醇，加熱回流提取2 h，過(guò)濾，濾渣再用相同條件提取1次，合并兩次提取物濾液。濾液回收乙醇即得酸角殼提取物浸膏。

1.5 酸角殼提取物對(duì)脂肪負(fù)荷大鼠血脂的影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、酸角殼提取物100，200 mg/kg組，每組8只。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前禁食12 h，各給藥組經(jīng)灌胃給藥，模型組灌胃給等體積蒸餾水。給藥30 min后，分別灌胃給予5 ml/kg橄欖油，并分別于橄欖油負(fù)荷前、負(fù)荷后于2，4，6，8 h經(jīng)尾靜脈取血，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定TG、FFA、TC和FC水平[4]。

1.6 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸內(nèi)脂肪酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、酸角殼提取物100和200 mg/kg組，每組8只。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前禁食12 h，各給藥組經(jīng)灌胃給藥，模型組灌胃給等體積蒸餾水。給藥30 min后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后開(kāi)腹，基于組織部位分析和實(shí)驗(yàn)操作的需要，按小腸長(zhǎng)度從上端起均分3等份剪開(kāi)，即小腸上段、中段及下段3個(gè)部位，小腸上段為十二指腸及空腸上段，小腸中段為空腸中段和下段，小腸下段為回腸。分別將腸內(nèi)容物取出，回收于特定容器中，取下小腸內(nèi)黏膜并回收于特定容器。與預(yù)冷生理鹽水按1:9 比例制成勻漿，分別測(cè)定不同部位的小腸內(nèi)黏膜及腸內(nèi)容物中的胰脂肪酶活性，同時(shí)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算和比較同等蛋白質(zhì)量中的酶活性及抑制率。抑制率計(jì)算公式：抑制率（%）=[(U模型-U給藥)/U模型]×100 %，其中U模型為模型組胰脂肪酶活性，U給藥為給藥組胰脂肪酶活性。

胰脂肪酶能以4-甲基傘形酮油酸酯（4-MU oleate)為底物，使其裂解并游離出油酸基團(tuán)，其產(chǎn)物4-甲基傘形酮（4-MU）具有熒光性質(zhì)，經(jīng)355 nm波長(zhǎng)激發(fā)，在 460 nm處產(chǎn)生發(fā)射光，測(cè)定4-MU含量可用于表示胰脂肪酶的活性。將小腸內(nèi)容物及內(nèi)黏膜制成的組織勻漿，4 ℃，10000 r/min離心10 min，取上清加入濃度為50 μmol/L 的4-MU oleate DMSO溶液，室溫下反應(yīng)30 min后，加入10.1 mol/L檸檬酸鈉溶液終止反應(yīng)。在激發(fā)波長(zhǎng)355 nm、發(fā)射波長(zhǎng)460 nm下檢測(cè)4-MU的熒光強(qiáng)度。胰脂肪酶活性其中Finitial為反應(yīng)起始時(shí)4-MU的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)final為反應(yīng)終止時(shí)4-MU的熒光強(qiáng)度，D為溶液稀釋倍數(shù)，T為反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，V為溶液體積[5]。

1.7 酸角殼提取物給藥后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小腸脂肪酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、給藥后0.5，1，2，3 h測(cè)定組，每組8只。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前禁食12 h，各給藥組經(jīng)灌胃給予酸角殼提取物100 mg/kg，模型組灌胃給等體積蒸餾水。不同測(cè)定組于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)，照1.7項(xiàng)方法分別取組織，測(cè)定不同部位的小腸內(nèi)黏膜及腸內(nèi)容物中的脂肪酶活性，同時(shí)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量[5]。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 酸角殼提取物對(duì)脂肪負(fù)荷大鼠血脂的影響

結(jié)果見(jiàn)表1～4。給予大鼠5 ml/kg橄欖油后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物TG水平明顯升高，均在負(fù)荷后6 h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，不同劑量的酸角殼提取物均能在一定程度上抑制TG值的上升，其中高劑量酸角殼提取物能顯著抑制橄欖油負(fù)荷后4 h和6 h的TG水平，TG波動(dòng)幅度較小，餐后反應(yīng)曲線比較平穩(wěn)。FFA是脂質(zhì)代謝的中間體，在給予橄欖油之后，各組FFA水平均有所上升，與模型組相比，酸角殼提取物組并不能顯著升高FFA水平。

橄欖油負(fù)荷后，TC和FC水平無(wú)明顯變化，給予酸角殼提取物后對(duì)TC和FC水平也無(wú)顯著影響。

表1 酸角殼提取物對(duì)大鼠橄欖油負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)血漿TG的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

表1 酸角殼提取物對(duì)大鼠橄欖油負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)血漿TG的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

組別 橄欖油負(fù)荷前 橄欖油負(fù)荷后2 h 橄欖油負(fù)荷后4 h 橄欖油負(fù)荷后6 h 橄欖油負(fù)荷后8 h模型組 0.27±0.06 1.35±0.19 2.75±0.14 3.12±0.25 2.18±0.31酸角殼提取物100 mg/kg組 0.24±0.05 0.96±0.21 2.01±0.38 2.48±0.54 1.72±0.32酸角殼提取物200 mg/kg組 0.45±0.04 0.72±0.18 1.34±0.35* 1.62±0.17** 1.68±0.66

表2 酸角殼提取物對(duì)大鼠橄欖油負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)血漿FFA的影響/μEq·L-1（± s，n=8）

表2 酸角殼提取物對(duì)大鼠橄欖油負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)血漿FFA的影響/μEq·L-1（± s，n=8）

組別 橄欖油負(fù)荷前 橄欖油負(fù)荷后2 h 橄欖油負(fù)荷后4 h 橄欖油負(fù)荷后6 h 橄欖油負(fù)荷后8 h模型組 854.7±81.4 1360.0±292.3 1464.7±242.3 2102.3±595.1 2517.3±694.2酸角殼提取物100 mg/kg組 883.0±57.3 1439.4±332.5 2586.5±684.3 2535.2±211.2 2742.2±603.9酸角殼提取物200 mg/kg組 1032.4±55.6 1512.8±353.6 2611.8±949.9 2747.0±852.4 2188.2±502.9

表3 酸角殼提取物對(duì)大鼠橄欖油負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)血漿TC的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

表3 酸角殼提取物對(duì)大鼠橄欖油負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)血漿TC的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

組別 橄欖油負(fù)荷前 橄欖油負(fù)荷后2 h 橄欖油負(fù)荷后4 h 橄欖油負(fù)荷后6 h 橄欖油負(fù)荷后8 h模型組 1.50±0.12 1.51±0.15 1.53±0.16 1.58±0.15 1.59±0.21酸角殼提取物100mg/kg組 1.31±0.28 1.36±0.25 1.43±0.26 1.22±0.13 1.38±0.25酸角殼提取物200mg/kg組 1.50±0.22 1.53±0.14 1.58±0.09 1.59±0.06 1.53±0.10

表4 酸角殼提取物對(duì)大鼠橄欖油負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)血漿FC的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

表4 酸角殼提取物對(duì)大鼠橄欖油負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)血漿FC的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

組別 橄欖油負(fù)荷前 橄欖油負(fù)荷后2h 橄欖油負(fù)荷后4h 橄欖油負(fù)荷后6h 橄欖油負(fù)荷后8h模型組 0.33±0.01 0.33±0.02 0.35±0.01 0.40±0.02 0.45±0.04酸角殼提取物100mg/kg組 0.27±0.02 0.28±0.02 0.36±0.03 0.35±0.03 0.38±0.02酸角殼提取物200mg/kg組 0.32±0.01 0.31±0.02 0.38±0.02 0.39±0.03 0.37±0.02

2.2 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸內(nèi)脂肪酶活性的影響

結(jié)果見(jiàn)表5～6。小腸內(nèi)容物中的脂肪酶活性遠(yuǎn)高于小腸黏膜中的脂肪酶活性，而小腸上段內(nèi)容物中脂肪酶活性最高，不同劑量的酸角殼提取物對(duì)小腸內(nèi)容物內(nèi)的脂肪酶活性均有較強(qiáng)的抑制作用，并顯示明顯的量效關(guān)系，其中，100 mg/kg酸角殼提取物的脂肪酶抑制率為48 %，200 mg/kg酸角殼提取物的脂肪酶抑制率為72 %。

表5 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸黏膜中胰脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質(zhì)（± s，n=8）

表5 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸黏膜中胰脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質(zhì)（± s，n=8）

組別 小腸上段 小腸中段 小腸下段模型組 3222.1±465.3 2211.2±433.1 1045.0±239.4酸角殼提取物100mg/kg組 2694.7±369.2 1325.2±262.7 852.9±202.4酸角殼提取物200mg/kg組 2757.5±334.1 1984.2±177.3 959.9±124.7

表6 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸內(nèi)容物中胰脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質(zhì)（± s，n=8）

表6 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸內(nèi)容物中胰脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質(zhì)（± s，n=8）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

組別 小腸上段 小腸中段 小腸下段模型組 13341.1±839.4 3340.4±463.2 163.2±42.0酸角殼提取物100 mg/kg組 7646.1±594.5*1561.6±189.2* 133.1±46.3酸角殼提取物200 mg/kg組 4670.4±485.1**2127.9±597.7 150.5±85.4

2.3 酸角殼提取物給藥后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小腸脂肪酶活性的影響

結(jié)果見(jiàn)表7～8。酸角殼提取物在給藥30 min和1 h后顯示較強(qiáng)的小腸脂肪酶的抑制作用，隨后抑制作用逐漸減弱，在給藥3 h后抑制作用基本消失。

表7 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸內(nèi)黏膜中脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質(zhì)（± s，n=8）

表7 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸內(nèi)黏膜中脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質(zhì)（± s，n=8）

注：*P＜0.05 vs 模型組

組別 給藥量/mg·kg-1 小腸上段 小腸中段 小腸下段模型組 ─ 5498.0±447.0 2336.1±276.8 710.0±150.5給藥后30min 100 4342.0±603.2 1090.5±168.9*1311.7±324.4給藥后1 h 100 6475.0±754.6 2156.9±262.2 996.0±210.7給藥后2 h 100 6346.5±653.3 2360.4±248.5 1036.9±200.8給藥后3 h 100 5081.7±268.3 2784.0±371.6 1039.2±262.1

表8 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸內(nèi)容物中脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質(zhì)（± s，n=8）

表8 酸角殼提取物對(duì)大鼠小腸內(nèi)容物中脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質(zhì)（± s，n=8）

注： **P＜0.01 vs 模型組

組別 給藥量/mg·kg-1 小腸上段 小腸中段 小腸下段模型組 ─ 27222.0±2393.1 10317.7±1724.21542.8±634.4給藥后30 min 100 5657.8±1000.6**2490.4±944.6**1311.7±349.9給藥后1 h 100 12530.5±1122.1**5039.0±631.5**1045.3±265.3給藥后2 h 100 15962.7±1939.7**6657.2±1270.3 1587.6±591.3給藥后3 h 100 20413.6±1495.9 9810.6±856.8 935.9±224.8

3 討論

本文結(jié)果表明，大鼠TG水平隨給予脂肪負(fù)荷上升，并在負(fù)荷后6 h達(dá)到峰值，而在脂肪負(fù)荷前后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的TC與FC水平均無(wú)明顯變化。這可能是由于TG可源于食物中脂肪的吸收與分解，因此在給予脂肪負(fù)荷后，TG水平顯著升高；而TC和FC大部分來(lái)源于體內(nèi)合成，受單次進(jìn)食影響較小。與模型組比較，酸角殼提取物能降低脂肪負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)的TG水平，使餐后TG波動(dòng)趨于平緩，提示酸角殼提取物能抑制餐后TG上升。

FFA是TG分解的中間體，給予脂肪負(fù)荷后，我們觀察到在TG水平上升同時(shí)，F(xiàn)FA水平隨之增加，但模型組與酸角殼提取物組之間的FFA水平無(wú)顯著性差異。酸角殼提取物在改善餐后TG水平的同時(shí)，不會(huì)顯著升高FFA水平，提示酸角殼提取物可能是通過(guò)抑制食物中脂肪水解吸收降低餐后TG水平。

胰脂肪酶能將食物中的脂肪水解，是食物中的脂肪在腸道消化吸收的關(guān)鍵酶之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸角殼提取物能顯著抑制大鼠小腸胰脂肪酶活性，提示酸角殼提取物通過(guò)抑制胰脂肪酶阻礙食物中的脂肪水解和吸收，進(jìn)而降低餐后TG水平。酸角殼提取物的胰脂肪酶抑制活性在給藥后30 min到1 h活性最強(qiáng)。

綜上所述，本文通過(guò)脂肪負(fù)荷模型探討了酸角殼提取物對(duì)餐后血脂的影響，同時(shí)評(píng)價(jià)了酸角殼提取物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制活性，結(jié)果表明，酸角殼提取物能顯著降低脂肪負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)的TG水平，并能顯著抑制小腸胰脂肪酶活性，提示酸角殼提取物通過(guò)抑制小腸胰脂肪酶活性，減少食物中脂肪的吸收，從而降低餐后TG水平。脂質(zhì)代謝紊亂，特別是餐后脂質(zhì)代謝紊亂常見(jiàn)于肥胖、高脂血癥、代謝綜合征和2型糖尿病，與這些疾病有著密切的關(guān)系[6]。同時(shí)，餐后血脂異常還對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展起著尤為重要的作用[7]，特別是餐后高TG無(wú)論對(duì)于代謝異常患者或正常人，均是動(dòng)脈粥樣硬化以及心血管疾病的高風(fēng)險(xiǎn)因素[8-9]。隨著生活方式改變，人們的脂肪消費(fèi)水平日漸增加，脂質(zhì)代謝紊亂發(fā)病率也隨之上升。研究表明，餐后血脂異常早于空腹血脂異常出現(xiàn)，積極調(diào)節(jié)和治療餐后高甘油三酯血癥有助于改善代謝綜合征，并能預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生[10-11]。酸角殼是酸角果實(shí)食用和加工的副產(chǎn)物，來(lái)源豐富，目前尚未得到充分研究，具有較好的開(kāi)發(fā)前景，同時(shí)，其作用機(jī)制也有待深入研究。