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        馬錢苷元的制備及抗炎活性研究

        2018-09-11 07:54:04杜丙源梁紅寶陳小榮齊長(zhǎng)鵬寧停波宮海蕊
        食品與藥品 2018年1期
        關(guān)鍵詞:美辛狀物山茱萸

        杜丙源,梁紅寶,陳小榮,齊長(zhǎng)鵬,寧停波,宮海蕊

        (山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司,山東 臨沂 273400)

        山茱萸是山茱萸科(Cornaceae)植物山茱萸Cornus officinalisSieb. et Zucc的成熟干燥果肉,是我國(guó)傳統(tǒng)珍稀藥材和常用名貴中藥,有澀精、斂汗、補(bǔ)肝腎[1]、降血糖[2]等功效,研究表明,山茱萸還可增強(qiáng)免疫力[3]、抗腫瘤[4]。山茱萸主要有效成分為馬錢苷。馬錢苷為環(huán)烯醚萜苷類成分[5],有降血糖、抗氧化[6]作用;吳云皓等[7]發(fā)現(xiàn)馬錢苷能改善糖基化終產(chǎn)物(AGE)誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞損傷;趙文望等[8]發(fā)現(xiàn)馬錢苷和莫諾苷通過(guò)促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá),抑制Bax蛋白表達(dá)和Caspase-3酶活性以抑制心肌細(xì)胞凋亡;黨文軍等[9]發(fā)現(xiàn)其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞有抑制作用。馬錢苷元為馬錢苷脫去一分子葡萄糖后得到的淡黃色油狀物,極性比馬錢苷小,易溶于水、乙醇等溶劑,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)初步探討了馬錢苷的Smith降解工藝,分離和確證水解產(chǎn)物,并研究水解產(chǎn)物抗炎活性,期望篩選活性更好的化合物,為進(jìn)一步研究開發(fā)馬錢苷及其衍生物提供科學(xué)依據(jù)。

        1 儀器與材料

        Ultimate3000高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific);Rotavapor R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi);ME204型電子天平(Mettler Toledo),馬錢苷原料(含量90 %,西安昊軒);馬錢苷元對(duì)照品(成都曼思特),吲哚美辛組(西安迪賽生物藥業(yè)),HPD450樹脂(河北寶恩樹脂),乙腈為色譜純,高碘酸鈉,硼氫化鈉,甘油,鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        色譜柱:Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(13:87);柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm;流速1 ml/min;進(jìn)樣量:10 μl。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 馬錢苷元制備

        2.1.1 氧化反應(yīng) 稱取馬錢苷10 g,加入10 %乙醇2000 ml溶解,在室溫條件下,加入30 g高碘酸鈉避光反應(yīng)6 h;加入50 ml甘油終止反應(yīng),濃縮至無(wú)醇味,用等體積正丁醇萃取3次,合并萃取液,濃縮備用。

        2.1.2 還原反應(yīng) 將2.1.1中的氧化產(chǎn)物用1 L 50 %乙醇溶解,加10 g硼氫化鈉,避光反應(yīng)2 h,調(diào)pH至中性,備用。

        2.1.3 水解反應(yīng) 將2.1.2得到的還原產(chǎn)物加入500 ml水,其他反應(yīng)參數(shù)酸度、溫度、反應(yīng)時(shí)間按表1,表2設(shè)計(jì)進(jìn)行篩選,反應(yīng)結(jié)束后,調(diào)pH至中性,濃縮至無(wú)醇味,濃縮液中加入等體積乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,濃縮即得粗品。

        表1 水解實(shí)驗(yàn)影響因素及水平

        表2 水解實(shí)驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)分組及結(jié)果

        2.1.4 精制純化 取上述粗品用5倍純化水溶解后,按物料比1:10用HPD450樹脂上樣吸附,然后按水,20 %,40 %,60 %乙醇依次進(jìn)行3倍柱體積洗脫,收集40 %乙醇洗脫液,濃縮至無(wú)醇味;濃縮液加入10 mg活性碳進(jìn)行吸附除雜,過(guò)濾后濃縮得淡黃色油狀物,經(jīng)HPLC檢測(cè)油狀物色譜純度>98 %。

        2.1.5 結(jié)果分析 由表3可見(jiàn),影響水解工藝馬錢苷元純度的因素影響程度B>C>A,其中影響最顯著的為水解溫度,而鹽酸的酸度和反應(yīng)時(shí)間影響不顯著;但是反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng),反應(yīng)產(chǎn)物最后的得率越高。綜合考慮生產(chǎn)成本和環(huán)保因素,得出最優(yōu)試驗(yàn)條件為A1B3C2,重復(fù)此水解工藝3批,得3批純度為 91.08 %,92.09 %,91.74 %,RSD=0.51 %,產(chǎn)率均達(dá)80 %以上。

        表3 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差直觀分析

        2.2 馬錢苷元結(jié)構(gòu)確證

        2.2.1 顏色反應(yīng) 取已煮熟雞蛋蛋清2 g,向蛋清滴加上述油狀物水溶液2滴,靜置2 h,觀察可見(jiàn),滴加上述油狀物水溶液處變藍(lán)色,表明此油狀物為環(huán)烯醚萜類化合物苷元[10]。

        2.2.2 ESI-MS分析

        圖1 油狀物ESI-MS分析圖

        由圖1可見(jiàn),油狀物的相對(duì)分子質(zhì)量為228.1[M-H]+,而馬錢苷元的相對(duì)分子質(zhì)量為228.24,兩者相同。

        2.2.3 HPLC-UV分析

        圖2 對(duì)照品與油狀物HPLC-UV分析圖

        由圖2可見(jiàn),經(jīng)Smith降解最后得到的油狀物與馬錢苷元對(duì)照品出峰時(shí)間一致。

        綜合上述3種方法分析可見(jiàn),此淡黃色油狀物即為馬錢苷元。

        2.3 抗炎活性研究

        采用小鼠耳腫脹法[11]研究馬錢苷元抗炎活性。取雄性小鼠50只,隨機(jī)分成5組,即生理鹽水空白組、吲哚美辛組及馬錢苷元高、中、低劑量組,分別按1.0,3.0,1.0,0.3 mg/kg配成水溶液灌胃;各組每日給藥1次,連續(xù)給藥3 d;最后一次給藥后1 h,將二甲苯50 μl涂于小鼠右耳正反兩面,致炎后30 min,脫臼處死小鼠;用內(nèi)徑6 mm直徑打孔器在小鼠左、右耳相同部位打孔,取下耳片,用電子天平稱重,計(jì)算左右耳重量差異及計(jì)算抑制率,結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 馬錢苷元對(duì)小鼠耳部腫脹的影響(n=10,x±s)

        由表4可見(jiàn),吲哚美辛對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫的具有明顯抑制作用,馬錢苷元各劑量組也有不同程度的抑制作用,尤以高劑量組最明顯;中劑量抗炎活性略低于高劑量的活性。

        3 討論

        在酸性或堿性條件下,酯基易水解斷裂,馬錢苷具有酯基結(jié)構(gòu),因此制備馬錢苷元時(shí)如直接采用酸水解或堿水解,副產(chǎn)物較多,甚至得不到馬錢苷元。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Smith降解可反應(yīng)得到馬錢苷元,Smith降解可有效保護(hù)酯基結(jié)構(gòu)在反應(yīng)過(guò)程中不易破壞,副產(chǎn)物少,易純化處理,可用于大規(guī)模生產(chǎn),為馬錢苷元的生產(chǎn)提供了一種參考方法。

        另外,利用二甲苯作為致炎因子,直觀可見(jiàn)造模一側(cè)的鼠耳有明顯腫脹,質(zhì)量明顯大于未造模的一側(cè),表明本次造模成功。結(jié)果表明,不同劑量的馬錢苷元均有抗炎活性,但是劑量不同,抗炎效果有差異,尤以高劑量的效果最佳,最接近陽(yáng)性對(duì)照吲哚美辛組的效果。

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