杜丙源，梁紅寶，陳小榮，齊長(zhǎng)鵬，寧停波，宮海蕊

（山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400）

山茱萸是山茱萸科（Cornaceae）植物山茱萸Cornus officinalisSieb. et Zucc的成熟干燥果肉，是我國(guó)傳統(tǒng)珍稀藥材和常用名貴中藥，有澀精、斂汗、補(bǔ)肝腎[1]、降血糖[2]等功效，研究表明，山茱萸還可增強(qiáng)免疫力[3]、抗腫瘤[4]。山茱萸主要有效成分為馬錢苷。馬錢苷為環(huán)烯醚萜苷類成分[5]，有降血糖、抗氧化[6]作用；吳云皓等[7]發(fā)現(xiàn)馬錢苷能改善糖基化終產(chǎn)物（AGE）誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞損傷；趙文望等[8]發(fā)現(xiàn)馬錢苷和莫諾苷通過(guò)促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)和Caspase-3酶活性以抑制心肌細(xì)胞凋亡；黨文軍等[9]發(fā)現(xiàn)其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞有抑制作用。馬錢苷元為馬錢苷脫去一分子葡萄糖后得到的淡黃色油狀物，極性比馬錢苷小，易溶于水、乙醇等溶劑，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)初步探討了馬錢苷的Smith降解工藝，分離和確證水解產(chǎn)物，并研究水解產(chǎn)物抗炎活性，期望篩選活性更好的化合物，為進(jìn)一步研究開發(fā)馬錢苷及其衍生物提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Ultimate3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；Rotavapor R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi）；ME204型電子天平（Mettler Toledo），馬錢苷原料（含量90 %，西安昊軒）；馬錢苷元對(duì)照品（成都曼思特），吲哚美辛組（西安迪賽生物藥業(yè)），HPD450樹脂（河北寶恩樹脂），乙腈為色譜純，高碘酸鈉，硼氫化鈉，甘油，鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

色譜柱：Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（13:87）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；流速1 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬錢苷元制備

2.1.1 氧化反應(yīng) 稱取馬錢苷10 g，加入10 %乙醇2000 ml溶解，在室溫條件下，加入30 g高碘酸鈉避光反應(yīng)6 h；加入50 ml甘油終止反應(yīng)，濃縮至無(wú)醇味，用等體積正丁醇萃取3次，合并萃取液，濃縮備用。

2.1.2 還原反應(yīng) 將2.1.1中的氧化產(chǎn)物用1 L 50 %乙醇溶解，加10 g硼氫化鈉，避光反應(yīng)2 h，調(diào)pH至中性，備用。

2.1.3 水解反應(yīng) 將2.1.2得到的還原產(chǎn)物加入500 ml水，其他反應(yīng)參數(shù)酸度、溫度、反應(yīng)時(shí)間按表1，表2設(shè)計(jì)進(jìn)行篩選，反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)pH至中性，濃縮至無(wú)醇味，濃縮液中加入等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，濃縮即得粗品。

表1 水解實(shí)驗(yàn)影響因素及水平

表2 水解實(shí)驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)分組及結(jié)果

2.1.4 精制純化 取上述粗品用5倍純化水溶解后，按物料比1:10用HPD450樹脂上樣吸附，然后按水，20 %，40 %，60 %乙醇依次進(jìn)行3倍柱體積洗脫，收集40 %乙醇洗脫液，濃縮至無(wú)醇味；濃縮液加入10 mg活性碳進(jìn)行吸附除雜，過(guò)濾后濃縮得淡黃色油狀物，經(jīng)HPLC檢測(cè)油狀物色譜純度＞98 %。

2.1.5 結(jié)果分析 由表3可見(jiàn)，影響水解工藝馬錢苷元純度的因素影響程度B＞C＞A，其中影響最顯著的為水解溫度，而鹽酸的酸度和反應(yīng)時(shí)間影響不顯著；但是反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn)物最后的得率越高。綜合考慮生產(chǎn)成本和環(huán)保因素，得出最優(yōu)試驗(yàn)條件為A1B3C2，重復(fù)此水解工藝3批，得3批純度為 91.08 %，92.09 %，91.74 %，RSD=0.51 %，產(chǎn)率均達(dá)80 %以上。

表3 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差直觀分析

2.2 馬錢苷元結(jié)構(gòu)確證

2.2.1 顏色反應(yīng) 取已煮熟雞蛋蛋清2 g，向蛋清滴加上述油狀物水溶液2滴，靜置2 h，觀察可見(jiàn)，滴加上述油狀物水溶液處變藍(lán)色，表明此油狀物為環(huán)烯醚萜類化合物苷元[10]。

2.2.2 ESI-MS分析

圖1 油狀物ESI-MS分析圖

由圖1可見(jiàn)，油狀物的相對(duì)分子質(zhì)量為228.1[M-H]+，而馬錢苷元的相對(duì)分子質(zhì)量為228.24，兩者相同。

2.2.3 HPLC-UV分析

圖2 對(duì)照品與油狀物HPLC-UV分析圖

由圖2可見(jiàn)，經(jīng)Smith降解最后得到的油狀物與馬錢苷元對(duì)照品出峰時(shí)間一致。

綜合上述3種方法分析可見(jiàn)，此淡黃色油狀物即為馬錢苷元。

2.3 抗炎活性研究

采用小鼠耳腫脹法[11]研究馬錢苷元抗炎活性。取雄性小鼠50只，隨機(jī)分成5組，即生理鹽水空白組、吲哚美辛組及馬錢苷元高、中、低劑量組，分別按1.0，3.0，1.0，0.3 mg/kg配成水溶液灌胃；各組每日給藥1次，連續(xù)給藥3 d；最后一次給藥后1 h，將二甲苯50 μl涂于小鼠右耳正反兩面，致炎后30 min，脫臼處死小鼠；用內(nèi)徑6 mm直徑打孔器在小鼠左、右耳相同部位打孔，取下耳片，用電子天平稱重，計(jì)算左右耳重量差異及計(jì)算抑制率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 馬錢苷元對(duì)小鼠耳部腫脹的影響（n=10，x±s）

由表4可見(jiàn)，吲哚美辛對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫的具有明顯抑制作用，馬錢苷元各劑量組也有不同程度的抑制作用，尤以高劑量組最明顯；中劑量抗炎活性略低于高劑量的活性。

3 討論

在酸性或堿性條件下，酯基易水解斷裂，馬錢苷具有酯基結(jié)構(gòu)，因此制備馬錢苷元時(shí)如直接采用酸水解或堿水解，副產(chǎn)物較多，甚至得不到馬錢苷元。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Smith降解可反應(yīng)得到馬錢苷元，Smith降解可有效保護(hù)酯基結(jié)構(gòu)在反應(yīng)過(guò)程中不易破壞，副產(chǎn)物少，易純化處理，可用于大規(guī)模生產(chǎn)，為馬錢苷元的生產(chǎn)提供了一種參考方法。

另外，利用二甲苯作為致炎因子，直觀可見(jiàn)造模一側(cè)的鼠耳有明顯腫脹，質(zhì)量明顯大于未造模的一側(cè)，表明本次造模成功。結(jié)果表明，不同劑量的馬錢苷元均有抗炎活性，但是劑量不同，抗炎效果有差異，尤以高劑量的效果最佳，最接近陽(yáng)性對(duì)照吲哚美辛組的效果。