（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.) Medic.的干燥花冠，作為藥用始于宋代[1]，收載于《中國藥典》2015年版一部，在民間有較多應(yīng)用。《嘉佑本草》記載黃蜀葵花“甘、寒、滑、無毒，主治小便淋及催生，治諸惡瘡、膿水久不痤者，作末敷之即愈，為瘡家要藥”?！侗静菥V目》記載“消癰腫，浸油，涂湯火傷”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃蜀葵花總黃酮具有良好的清熱利濕解毒功效，進(jìn)一步藥理試驗(yàn)研究顯示黃蜀葵花總黃酮具有明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗病毒及促進(jìn)愈合等藥理作用[2-6]。

在質(zhì)量控制方面，《中國藥典》2015年版一部收載的黃蜀葵花藥材僅規(guī)定了單一成分金絲桃苷的含量測(cè)定方法及含量限度，未制定總黃酮含量測(cè)定方法及含量限度；《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2012年版）》中黃蜀葵花項(xiàng)下亦未制定總黃酮含量測(cè)定方法及含量限度；《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1989年版）增補(bǔ)本》中收載的黃蜀葵花藥材總黃酮含量測(cè)定是采用蘆丁為對(duì)照，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法進(jìn)行測(cè)定，該方法也是黃酮類成分含量測(cè)定最常用的方法。但由于黃蜀葵花藥材本身不含蘆丁，相似結(jié)構(gòu)的黃酮雙糖苷成分在藥材中含量又極低，因此以蘆丁為對(duì)照品的測(cè)定方法不夠準(zhǔn)確合理。隨著對(duì)黃蜀葵花化學(xué)成分研究的深入，其主要含有的黃酮成分是以金絲桃苷為代表的黃酮單糖苷化合物，且金絲桃苷也被證實(shí)是其抗炎鎮(zhèn)痛的有效成分[7-8]，因此近年對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量測(cè)定的研究主要集中在以金絲桃苷為對(duì)照品，采用各種不同顯色劑顯色后進(jìn)行含量測(cè)定。

文獻(xiàn)[9]報(bào)道了采用金絲桃苷為對(duì)照品，對(duì)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色（B法）、不顯色直接測(cè)定（C法）、醋酸醋酸鈉緩沖液-三氯化鋁顯色（D法），及采用蘆丁為對(duì)照品、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色（A法）4種方法進(jìn)行了比較研究，認(rèn)為D法（醋酸醋酸鈉緩沖液-三氯化鋁顯色）測(cè)定黃蜀葵花中總黃酮含量相對(duì)準(zhǔn)確；而以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色（B法）時(shí)，藥材所含的槲皮素-3’-葡糖苷、棉皮素-3’-葡糖苷和楊梅素不顯紅色，因此，B法造成測(cè)得的總黃酮含量偏低；而不顯色直接測(cè)定（C法）由于藥材中鞣質(zhì)含量較高，在同一波長258 nm處有很強(qiáng)的紫外吸收，導(dǎo)致C法測(cè)定結(jié)果偏高；以蘆丁為對(duì)照品的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法（A）法測(cè)定結(jié)果不及以金絲桃苷為對(duì)照測(cè)定結(jié)果合理準(zhǔn)確。

目前隨著黃蜀葵花研究的逐步深入，及中醫(yī)臨床應(yīng)用的日漸廣泛，為尋求一種切實(shí)可行、簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的黃蜀葵花總黃酮含量測(cè)定方法，我們對(duì)上述C法及D法進(jìn)行了比較研究，研究確定了一種黃蜀葵花總黃酮含量測(cè)定的最佳方法。

1 儀器與試藥

Agilent 8453 UV-Vis分光光度計(jì)（美國安捷倫）；Mettler AE200分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；金絲桃苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院）；黃蜀葵花藥材經(jīng)鑒定為黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.) Medic.的干燥花冠。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋酸醋酸鈉緩沖液-三氯化鋁顯色測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加75 %乙醇提取6 h，提取液置100 ml量瓶中，加乙醇至刻度，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 ml含金絲桃苷80μg的溶液，即得。

2.1.3 測(cè)定波長的選擇 取對(duì)照品溶液3 ml，供試品溶液1 ml，分別置25 ml量瓶中，分別加水至5.0 ml，精密加入醋酸-醋酸鈉緩沖液（2 mol/L醋酸溶液:2 mol/L醋酸鈉溶液=3:1）5.0 ml和0.1 mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，加水定容至刻度，搖勻，放置40 min；取水5.0 ml，同法制得空白對(duì)照溶液。200～800 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線。結(jié)果表明，金絲桃苷對(duì)照品溶液與黃蜀葵花藥材供試品溶液的最大吸收波長不一致，對(duì)照品溶液最大吸收為398 nm，而供試品溶液最大吸收為412 nm。

2.1.4 黃蜀葵花藥材總黃酮含量測(cè)定結(jié)果 分別以398 nm和412 nm作為測(cè)定波長，測(cè)定了黃蜀葵花藥材總黃酮含量，結(jié)果見表1。

表1 黃蜀葵花藥材不同波長測(cè)定總黃酮含量結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同波長測(cè)定的黃蜀葵花藥材總黃酮含量相差約10 %。

2.2 不顯色直接測(cè)定（C法）

2.2.1 供試品溶液的制備 取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷80 μg的溶液，即得。

2.2.3 測(cè)定波長的選擇 取對(duì)照品溶液3 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻；取供試品溶液1 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻；以50 %甲醇為空白，在200～800 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線。結(jié)果表明，金絲桃苷對(duì)照品與黃蜀葵花藥材供試品溶液在257 nm波長處均有相同的最大吸收。

2.2.4 黃蜀葵花藥材總黃酮含量測(cè)定結(jié)果 精密量取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，分別置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻。以50 %甲醇為空白，在256 nm波長處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取供試品溶液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，在256 nm處測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中金絲桃苷的量，測(cè)得總黃酮含量為5.08 %。

2.3 C法和D法測(cè)定不同來源黃蜀葵花藥材含量比較

取不同來源黃蜀葵花藥材，分別采用不顯色直接測(cè)定（C法）、醋酸醋酸鈉緩沖液-三氯化鋁顯色（D法，398 nm波長）測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見表2。

表2 不同來源黃蜀葵花藥材總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，C法和D法測(cè)定不同來源黃蜀葵花藥材總黃酮含量相差約6 %～8 %。C法較D法具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，因此選擇C法作為黃蜀葵花總黃酮含量測(cè)定方法。

2.4 不顯色直接測(cè)定（C法）的供試品溶液制備方法優(yōu)選

采用不顯色直接測(cè)定法，進(jìn)一步對(duì)黃蜀葵花藥材供試品溶液的制備方法，包括提取方法、提取時(shí)間及提取溶劑進(jìn)行了優(yōu)選和比較。

2.4.1 不同提取方法黃蜀葵花藥材總黃酮含量比較 對(duì)比索氏提取和回流提取法制備的總黃酮含量進(jìn)行比較。

索氏提取：稱取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）80 ml，加熱回流1 h，棄去石油醚液，藥渣揮干，加入甲醇80 ml，加熱回流5 h，將甲醇轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為索氏提取的供試品溶液。

回流提?。悍Q取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為回流提取的供試品溶液。

分別精密吸取上述供試品溶液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項(xiàng)方法測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見表3。

表3 黃蜀葵花藥材不同提取方法總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，兩種提取方法總黃酮含量無明顯差異，回流操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，效率高。

2.4.2 不同提取時(shí)間黃蜀葵花總黃酮含量比較 稱取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，分別加熱回流1，2，3 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，分別精密吸取續(xù)濾液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項(xiàng)方法測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，提取1 h總黃酮含量較低，提取2 h與3 h總黃酮含量無明顯差別，說明2 h即可提取完全。

表4 黃蜀葵花藥材不同提取時(shí)間總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

2.4.3 不同提取溶劑黃蜀葵花總黃酮含量比較 分別取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別精密加入甲醇，乙醇100 ml，分別稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，分別精密吸取續(xù)濾液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項(xiàng)方法測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見表5。

表5 黃蜀葵花藥材不同提取溶劑總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑，提取物中總黃酮含量較高。

2.4.4 聚酰胺柱除雜對(duì)提取物總黃酮含量的影響比較 取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，共取2份，分別精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，一份精密吸取續(xù)濾液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項(xiàng)方法測(cè)定總黃酮含量；另一份精密量取續(xù)濾液10 ml，蒸干，殘?jiān)铀? ml分次溶解，加至聚酰胺柱（60～90目，1.0 g，內(nèi)徑1.0 cm），用70 %甲醇50 ml洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項(xiàng)方法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果見表6。

表6 黃蜀葵花藥材不同純化處理總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)聚酰胺柱純化后的總黃酮含量與未經(jīng)聚酰胺柱純化無明顯差異。

2.5 不顯色直接測(cè)定（C法）的含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 取金絲桃苷對(duì)照品約8 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取2.5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1 ml含金絲桃苷80 μg）。精密量取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，分別置25 ml量瓶中，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，以50 %甲醇作為空白，256 nm波長處測(cè)定吸光度（A），以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：A=-6.3996×10-5＋2.2938×10-2C，r=0.99980，表明金絲桃苷在0.003132～0.018792 mg/ml范圍內(nèi)與其吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品和供試品溶液，按2.2.4項(xiàng)方法操作，并依法測(cè)定放置不同時(shí)間的吸光度，對(duì)照品溶液吸光度RSD為0.54 %，供試品溶液吸光度RSD為0.52 %，表明樣品在80 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取金絲桃苷對(duì)照品8 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密量取對(duì)照品溶液4.0 ml（共5份），置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項(xiàng)方法操作，測(cè)定吸光度（A），計(jì)算RSD=0.39 %；同一對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定5次吸光度，計(jì)算RSD=0.28 %，說明該方法有較好的精密度。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取黃蜀葵花藥材粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，按2.2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液并按2.2.4項(xiàng)方法測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見表7。

表7 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.5.5 回收率試驗(yàn) 取黃蜀葵花藥材粉末（總黃酮含量為5.10 %）6份，每份0.25 g，精密稱定，分別精密加入金絲桃苷對(duì)照品約12 mg，按2.2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液并按2.2.4項(xiàng)方法測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表8。

表8 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 本試驗(yàn)對(duì)兩種黃蜀葵花藥材總黃酮含量測(cè)定方法C法及D法進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明C法和D法測(cè)定總黃酮含量相差6 %～8 %，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的兩種方法測(cè)定結(jié)果相同。

3.2 2006年文獻(xiàn)[9]報(bào)道的C法和D法測(cè)定總黃酮含量相差6 %～8 %，分析是由于黃蜀葵花藥材中的鞣質(zhì)干擾總黃酮含量測(cè)定，導(dǎo)致C法測(cè)定結(jié)果偏高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，二者測(cè)定結(jié)果存在差異的原因?yàn)椋菏紫龋珼法對(duì)照品溶液與供試品溶液的最大吸收波長不一致，對(duì)照品溶液最大吸收波長為398 nm，而供試品溶液的最大吸收波長為412 nm，導(dǎo)致測(cè)得的總黃酮含量偏低2 %～3 %；其次，D法采用乙醇為提取溶劑，研究結(jié)果顯示，與甲醇相比，乙醇提取總黃酮含量低約5 %；再次，進(jìn)一步測(cè)定了黃蜀葵花藥材中鞣質(zhì)的含量，結(jié)果表明其鞣質(zhì)含量約1 %～2 %。

3.3 經(jīng)聚酰胺柱純化后的供試液測(cè)得總黃酮含量與未經(jīng)聚酰胺柱純化測(cè)定結(jié)果無明顯差異。

3.4 此外研究發(fā)現(xiàn)，D法采用的索氏提取操作繁瑣，耗時(shí)6個(gè)多小時(shí)，而C法采用回流提取僅需2 h，兩種提取方法總黃酮含量無明顯差異，回流提取明顯縮短了供試品溶液的制備時(shí)間，提高了工作效率。

綜上，試驗(yàn)結(jié)果表明，C法具有供試液與對(duì)照品金絲桃苷最大吸收一致，無需加入醋酸-醋酸鈉緩沖液、三氯化鋁等顯色劑，操作簡(jiǎn)便及穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，且具有很好的準(zhǔn)確性和精密度，為目前測(cè)定黃蜀葵花藥材及其制劑中總黃酮含量的最佳測(cè)定方法。