廖 芳 ，王 歡 ，譚天林 ，陳緯別 ，馬書(shū)軍 ，張 丹

1成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610500；2西南醫(yī)科大學(xué)

醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑是新藥研發(fā)的搖籃，是市售藥品的補(bǔ)充，在臨床治療中發(fā)揮非常重要的作用。但醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑常存在工藝研究粗糙，生產(chǎn)質(zhì)量可控性較差等缺點(diǎn)。強(qiáng)筋接骨膠囊是我院名中醫(yī)蘭宗煥主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)方，功效為強(qiáng)筋接骨，散瘀止痛，臨床常用于跌打損傷所致的局部疼痛、瘀腫。方中骨碎補(bǔ)苦、溫，補(bǔ)腎強(qiáng)骨，續(xù)傷止痛為君藥；川芎辛、溫，活血行氣，祛風(fēng)止痛；當(dāng)歸甘、辛、苦、溫，補(bǔ)血、活血，二者共為臣藥。該制劑在我院臨床應(yīng)用十余年，療效顯著。現(xiàn)擬對(duì)該制劑的提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步研究，擬采用多指標(biāo)評(píng)價(jià)正交試驗(yàn)法對(duì)該制劑提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以提升該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 試藥與儀器

1.1 藥材及試劑 藥材購(gòu)自四川民康藥業(yè)有限公司；對(duì)照品柚皮苷(批號(hào)：110722-201312)、阿魏酸(批號(hào)：110773-201313)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜純(昌泰興業(yè)有限公司)；水為反滲透純化水。

1.2 儀器 Agilent Tcehnologies 1260高效液相色譜儀(G1311C四元泵，G4212B檢測(cè)器，G1316A柱溫箱)；色譜柱為Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AB204-N 型電子分析天平(梅特勒 -托利多儀器上海有限公司)；DL-360型超聲波清洗劑(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)；TC-15型套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件選擇 參考文獻(xiàn)［1］，當(dāng)歸、川芎的代表性成分阿魏酸及骨碎補(bǔ)代表性成分柚皮苷的流動(dòng)相中均有甲醇、醋酸溶液，因此，試驗(yàn)中以一定比例的甲醇、4%的醋酸水溶液為流動(dòng)相，柱溫35℃，同時(shí)檢測(cè)柚皮苷和阿魏酸。

以 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)為固定相，283 nm、321 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，柱溫35℃，比較以下流動(dòng)相系統(tǒng)。見(jiàn)圖1。1)甲醇∶4%醋酸水 =19∶81；2)甲醇∶4%醋酸水 =20∶80；3)甲醇∶4%醋酸水 =22∶78；4)甲醇∶4%醋酸水 =23∶77；5)甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =15∶5∶80；6)甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80

圖1 不同溶劑系統(tǒng)HPLC分離圖譜

結(jié)果顯示，系統(tǒng)4)5)6)均有較好的分離度，較好的峰型，經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，結(jié)合《中醫(yī)藥典》方法，確定此次工藝優(yōu)化液相檢測(cè)條件為：以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80 為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為321 nm和283 nm，柱溫35℃，流速1 mL/min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備［2-3］柚皮苷對(duì)照品溶液制備：取柚皮苷對(duì)照品0.012 0 g，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷240 μg的溶液。阿魏酸對(duì)照品溶液制備：取阿魏酸對(duì)照品0.010 0 g，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸400 μg的溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察［4-5］精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液 0.125、0.625、1.25、2.5、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度；精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液 0.25、1.25、2.5、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度。

分別吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80 為流動(dòng)相，柱溫 35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為283、321 nm，流速1 mL/min的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X，μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 直線回歸方程與線性范圍

2.4 精密度考察 取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積并計(jì)算其RSD，結(jié)果表明儀器精密度好。見(jiàn)表2。

2.5 穩(wěn)定性考察 精密吸取供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下，分別于 0、2、4、8、12、24、48、72小時(shí)進(jìn)行進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果分析表明，供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表3。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.6 提取工藝優(yōu)化

2.6.1 正交實(shí)驗(yàn) 為了優(yōu)化提取工藝，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及處方配比，稱(chēng)取620 g藥材，選擇提取倍量(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，按L(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)(提取溶媒為水)。實(shí)驗(yàn)安排表見(jiàn)表4，結(jié)果見(jiàn)表5—6。

表4 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表6 方差分析結(jié)果

由表6方差分析得出：影響因素大小為C＞A＞B，提取次數(shù)(C)對(duì)提取工藝有顯著影響，直觀分析最佳方案為A3B3C3，但經(jīng)方差分析可知加水量和提取時(shí)間各水平間無(wú)明顯區(qū)別，提取次數(shù)2、3水平之間無(wú)明顯差異。從節(jié)約能源，降低成本的角度出發(fā)，故將 A3調(diào)整為 A1，B3調(diào)整為 B1，C3調(diào)整為C2，即 A1B1C2，加水量為 6 倍水，提取時(shí)間為 60 min，提取次數(shù)為2次。

2.6.2 正交結(jié)果驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案的可行性和穩(wěn)定性，稱(chēng)取同樣處方量，按上述較佳實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，平行3份。見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按選定的提取方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示3個(gè)評(píng)定指標(biāo)較正交試驗(yàn)中組分偏高表明該提取方法穩(wěn)定可行。

3 討論

在含量測(cè)定中，《中國(guó)藥典》所載方法，是針對(duì)單一成分，在實(shí)際操作過(guò)程中，重復(fù)操作繁雜，工作量大。參考相關(guān)文獻(xiàn)［6-10］。本實(shí)驗(yàn)將方中3味藥材的代表性成分柚皮苷、阿魏酸在同一溶劑系統(tǒng)下進(jìn)行含量測(cè)定，分離度較好，峰形佳，優(yōu)化該工藝中液相檢測(cè)條件，減少操作步驟，降低了工作量。

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 本試驗(yàn)采VWD紫外檢測(cè)器，在321 nm檢測(cè)阿魏酸，在283 nm檢測(cè)柚皮苷，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為各成分的最大吸收處，使上述2種成分均有最大的相應(yīng)，便于對(duì)各組分的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

3.2 參考文獻(xiàn)顯示，同時(shí)測(cè)定多種成分，需要梯度洗脫 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)流動(dòng)相的反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，未采用梯度洗脫的方法，實(shí)現(xiàn)以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水=16∶4∶80 為流動(dòng)相時(shí)，阿魏酸在 283 nm 及柚皮苷在321 nm處基線平穩(wěn)，均有較好的分離度，較好的峰型，靈敏度高。