李文麗，劉 霞*，劉在新，盧曾軍，范朋舉

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus expression vector systems，BEVS)是基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一，是一個(gè)以昆蟲(chóng)桿狀病毒為外源基因載體、以昆蟲(chóng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞(Sf-9)為受體的表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾加工、克隆容量大、生物安全性好、可同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。昆蟲(chóng)桿狀病毒有多種表達(dá)載體系統(tǒng)，包括經(jīng)典的體內(nèi)重組策略、線性化桿狀病毒[3]、Bac-to-Bac系統(tǒng)等，其中應(yīng)用Bac-to-Bac系統(tǒng)獲得重組病毒的方法是直接從細(xì)菌中獲得。重組桿狀病毒還可以進(jìn)入某些哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系[4]，為基因治療提供可能。除此之外，基于桿狀病毒的宿主特異性，昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)還可應(yīng)用于生物防治[5]。

目前，BEVS較為廣泛地應(yīng)用于生物制藥、生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，例如生產(chǎn)VLPs疫苗[6]、生產(chǎn)重組蛋白[7]等。所得到的重組蛋白可以作為刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的免疫原，應(yīng)用于單克隆抗體的生產(chǎn)[8]。Martinez等[9]采用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PPV-VP2蛋白，電鏡觀察表達(dá)的VP2蛋白可以自行組裝成VLPs，動(dòng)物試驗(yàn)顯示其具有良好的免疫效果。范朋舉[10]通過(guò)電鏡觀察證明，嵌合FMDV中和表位的PPV-VLPs可以組裝產(chǎn)生類似于PPV自然病毒粒子的VLPs結(jié)構(gòu)，但并未對(duì)嵌合蛋白L2S在懸浮Sf-9細(xì)胞中大量表達(dá)的最佳條件進(jìn)行深入研究。本研究將在此基礎(chǔ)上利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)和豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的衣殼蛋白，探究其表達(dá)的最佳條件，以期獲得大量具有生物學(xué)活性的嵌合蛋白L2S，為研發(fā)具有同時(shí)抗FMDV和PPV雙重免疫效果的表位嵌合疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

嵌合FMDV中和表位PPV的P1代重組病毒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。病毒DNA提取試劑盒、RNase-Free ddH2O、TaKaRa病毒滴定試劑盒、DL12000 DNA Marker、Sf-9細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基SFM 900Ⅲ均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)胞裂解液RIPA、ECL工作液均購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 Sf-9細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 貼壁培養(yǎng)Sf-9細(xì)胞 將細(xì)胞從液氮中快速取出在37 ℃水中迅速溶解，在細(xì)胞瓶中加入SFM 900Ⅲ培養(yǎng)基6 mL，取Sf-9細(xì)胞1 mL輕輕吹打混勻后加入培養(yǎng)基中，放至28 ℃溫箱，無(wú)CO2條件下培養(yǎng)12～24 h，定時(shí)更換新的培養(yǎng)基，每天觀察細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代。

1.2.1.2 懸浮培養(yǎng)Sf-9細(xì)胞 將貼壁細(xì)胞輕輕拍打下來(lái)，然后計(jì)數(shù)，以初始密度為3×104～5×104個(gè)/mL接種量接種到30 mL帶有透氣塞子的三角瓶中，放到恒溫?fù)u床上，無(wú)CO2、28 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制懸浮培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 重組病毒感染Sf-9細(xì)胞 將P1代重組病毒離心，取上清，按0.01個(gè)感染復(fù)數(shù)(MOI)病毒液感染貼壁Sf-9細(xì)胞，1 h后加入新的培養(yǎng)基SFM 900Ⅲ，每天觀察細(xì)胞病變情況，直到完全病變后收集細(xì)胞，在-70 ℃冰箱反復(fù)凍融3次后于4 ℃冰箱保存，直到獲得高滴度的P3代重組病毒[11-12]。

1.2.3 桿狀病毒滴定試劑盒測(cè)定病毒滴度 收獲P3代重組病毒，提取病毒DNA，進(jìn)行qPCR試驗(yàn)。用EASY稀釋緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)DNA，將其進(jìn)行10-7、10-6、10-5、10-4倍稀釋。按以下加到96孔板中，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，熒光染料0.4 μL，qPCR混合物10 μL，PCR-Grade H2O 6.8 μL，標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA 2 μL。分析熒光定量數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)復(fù)制拷貝數(shù)，計(jì)算出病毒滴度。

1.2.4 重組病毒PCR鑒定 為確保目的基因不因傳代而丟失，P3代重組病毒感染細(xì)胞前要進(jìn)行PCR鑒定。用病毒DNA試劑盒提取重組桿狀病毒DNA[13]，取200 μL重組桿狀病毒P3代毒株，加入到1.5 mL離心管中，然后加入200 μL Buffer AL和25 μL蛋白酶，劇烈振蕩混勻，56 ℃恒溫放置15 min；加入250 μL乙醇，反復(fù)顛倒混合均勻，振蕩15 s，室溫靜置5 min；將試劑盒中的收集柱安裝到新的收集管中，將上一步混合好的液體加入收集柱中8 000 r/min，離心1 min，棄廢液，更換新的收集管；加入500 μL Buffer AW1到收集柱中，8 000 r/min離心1 min，棄廢液，更換新的收集管；加入500 μL Buffer AW2到收集柱中，8 000 r/min離心1 min，棄廢液，更換新的收集管；加入500 μL乙醇到收集柱中，8 000 r/min離心1 min，棄廢液，更換新的收集管；14 000 r/min 離心1 min，快速干燥；56 ℃恒溫放置3 min，徹底干燥；將收集柱安裝到新的1.5 mL離心管上，在收集柱的膜中央加入50 μL的RNase free H2O，室溫靜置5 min；14 000 r/min離心1 min洗脫，洗脫的液體即為重組病毒DNA。

以M13-F：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13-R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′為擴(kuò)增引物，DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 重組病毒最佳增值條件的優(yōu)化 分別以0.01、0.05、0.1個(gè)MOI轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期懸浮Sf-9細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)96 h后每24 h收集少量細(xì)胞[12]，-70 ℃冰箱反復(fù)凍融3次，離心取上清，用病毒DNA提取試劑盒提取病毒DNA，然后用病毒滴定試劑盒測(cè)定病毒復(fù)制的拷貝數(shù)，選出最佳MOI和感染時(shí)間，從而大量感染懸浮Sf-9細(xì)胞獲得高滴度的病毒。

1.2.6 重組蛋白L2S的表達(dá)與檢測(cè)

1.2.6.1 重組蛋白L2S表達(dá)條件的優(yōu)化 以0.5、1、5、10個(gè)MOI病毒液分別感染懸浮Sf-9細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)24～96 h，每24 h收集少量細(xì)胞沉淀，用細(xì)胞裂解液冰上裂解30～60 min，離心取上清加4×蛋白質(zhì)上樣Buffer處理， Western blot分析篩選出最佳的重組蛋白表達(dá)條件[13]。

1.2.6.2 重組蛋白L2S的表達(dá) SDS-PAGE電泳：12%的SDS-PAGE電泳凝膠，取處理好的蛋白質(zhì)樣品15 μL加入對(duì)應(yīng)的電泳凝膠孔內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker 10 μL，140 V電泳1 h。轉(zhuǎn)膜：SDS-PAGE電泳后的凝膠切去多余部分，取在甲醇溶液中浸泡活化的后聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和1層厚濾紙，按照負(fù)極板、1層厚濾紙、膠、PVDF膜、1層厚濾紙的順序排列整齊，確保各層之間沒(méi)有氣泡，蓋上正極板，于160 mA恒流下轉(zhuǎn)膜1 h。封閉：將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜取下，放入含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉液中，4 ℃過(guò)夜。一抗孵育：用含50 g/L 脫脂奶粉的TBST溶液按1∶2 000稀釋PPV兔抗血清和O型FMDV兔抗血清，后將封閉好的PVDF膜置于其中，37 ℃輕搖孵育2 h，孵育結(jié)束后用TBST 漂洗1～4 次，每次6 min。二抗孵育：將羊抗兔和兔抗豬IgG-HRP分別用含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液按進(jìn)1∶4 000稀釋，后將漂洗好的PVDF膜置于其中，37 ℃輕搖孵育1 h，孵育結(jié)束后用TBST漂洗5～6次，每次10 min。底物顯色：將PVDF膜轉(zhuǎn)移到10 mL的DAB底物顯色液中避光反應(yīng)30 s，條帶出現(xiàn)后，立即取出PVDF膜放入清水中漂洗，拍照保存結(jié)果。蛋白質(zhì)檢測(cè)：將PVDF膜放置暗盒中，加入ECL工作液顯色曝光[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sf-9細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

圖1A所示，貼壁Sf-9細(xì)胞邊緣不整齊，大小不均一，有的呈橢圓型，細(xì)胞結(jié)團(tuán)比較嚴(yán)重，還有些死細(xì)胞；圖1B所示，懸浮Sf-9細(xì)胞比貼壁Sf-9細(xì)胞形態(tài)好，邊緣整齊，大小均一，呈圓形，結(jié)團(tuán)現(xiàn)象不太明顯。對(duì)比得出,Sf-9細(xì)胞更適合懸浮培養(yǎng)。

A：貼壁Sf-9細(xì)胞；B：懸浮Sf-9細(xì)胞

2.2 懸浮Sf-9細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

隨著細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中不斷適應(yīng)和傳代，血清對(duì)細(xì)胞活性的改善不明顯，故選擇無(wú)血清培養(yǎng)Sf-9細(xì)胞[15]。Sf-9細(xì)胞以初始密度為3×105個(gè)/mL的接種量接種，連續(xù)培養(yǎng)8 d，每隔1 d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。由圖2可知，在第7天細(xì)胞密度達(dá)到最大值，第8天后細(xì)胞數(shù)下降，試驗(yàn)選擇4～5 d處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞[16]。

圖2 懸浮Sf-9細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 重組病毒的擴(kuò)增

用P1代重組病毒L2S感染對(duì)數(shù)期Sf-9細(xì)胞，連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)。當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，細(xì)胞直徑變大，細(xì)胞核體積增大，細(xì)胞具有顆粒狀外觀，部分細(xì)胞脫落、裂解等現(xiàn)象時(shí)(圖3)，收集細(xì)胞，持續(xù)感染得到P3代重組病毒。

A：正常狀態(tài)下的Sf-9細(xì)胞；B：轉(zhuǎn)染重組病毒72 h的Sf-9細(xì)胞

2.4 重組病毒PCR鑒定結(jié)果

將P1代重組病毒擴(kuò)增到P3代，用病毒DNA試劑盒提取桿狀病毒基因DNA，以M13為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR鑒定，檢測(cè)插入目的基因的完整性。經(jīng)PCR鑒定顯示，重組病毒大小為4 374 bp，與重組桿粒 PCR鑒定結(jié)果一致[10]，如圖4所示，表明插入的目的基因完整，可以大量感染Sf-9細(xì)胞以進(jìn)行重組蛋白L2S的表達(dá)。

在P3代毒株感染Sf-9細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)之前，進(jìn)行P3代毒株病毒滴度檢測(cè)，本試驗(yàn)采用病毒滴定試劑盒測(cè)定P3代毒株的病毒滴度。經(jīng)過(guò)病毒滴定試劑盒測(cè)定的重組病毒拷貝數(shù)換算成病毒滴度為6.3×106pfu/mL。

M：DL12000 DNA Marker；1—4：重組病毒

2.5 重組病毒增殖條件優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)用不同MOI感染病毒來(lái)研究病毒復(fù)制最佳條件，結(jié)果如圖5所示，重組病毒在0.05個(gè)MOI、72 h時(shí)收獲病毒病毒的復(fù)制拷貝數(shù)達(dá)到最高，為2.3×106拷貝/mL，故選擇在此條件下感染懸浮Sf-9細(xì)胞以獲得大量高滴度重組病毒，為后續(xù)重組蛋白L2S最佳表達(dá)條件的優(yōu)化做準(zhǔn)備。

A：感染MOI=0.01的懸浮Sf-9細(xì)胞；B：感染MOI=0.05的懸浮Sf-9細(xì)胞；C：感染MOI=0.1的懸浮Sf-9細(xì)胞

2.6 重組蛋白L2S表達(dá)與最佳表達(dá)條件篩選結(jié)果

將優(yōu)化重組病毒增殖條件后獲得的大量高滴度病毒液分別以0.5、1、5、10個(gè)MOI感染懸浮Sf-9細(xì)胞[17]，連續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 h離心收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞，離心后取上清用于SDS-PAGE凝膠電泳，并于轉(zhuǎn)膜后加PPV兔抗血清孵育，再加山羊抗兔酶標(biāo)二抗進(jìn)行孵育，如圖6所示，DAB顯色后在膜上出現(xiàn)特異性67 ku條帶。進(jìn)一步用Western blot驗(yàn)證插入的FMDV中和表位的存在，首先用O型FMDV豬抗血清作為一抗孵育，再加兔抗豬酶標(biāo)二抗孵育，如圖7所示，DAB顯色后在膜上也出現(xiàn)特異性67 ku左右的條帶。將放射自顯影圖片用Image J軟件計(jì)算出灰度值，通過(guò)灰度值大小對(duì)比得出，重組蛋白L2S在10個(gè)MOI、72 h感染條件下重組蛋白L2S表達(dá)量最大，即為重組蛋白L2S最佳表達(dá)條件。在此最佳表達(dá)條件下大量感染懸浮Sf-9細(xì)胞，以獲得大量重組蛋白L2S，可為后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

圖6 O型FMDV豬抗血清檢測(cè)重組蛋白表達(dá)

圖7 PPV兔抗血清檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基SFM 900Ⅲ具有細(xì)胞密度高、培養(yǎng)基成分明確、易于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[18]。張寶珠[19]研究發(fā)現(xiàn)，Sf-9細(xì)胞在低血清甚至無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。李偉等[20]對(duì)Sf-9昆蟲(chóng)細(xì)胞在不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)基中是否添加血清及不同生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)工藝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Sf-9細(xì)胞在SFM 900Ⅲ無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)比在添加10%小牛血清的Grace培養(yǎng)基中更好。本研究在無(wú)血清培養(yǎng)基SFM 900Ⅲ的培養(yǎng)條件下進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)Sf-9細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

本研究通過(guò)對(duì)比貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)2種培養(yǎng)條件，得出在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞形態(tài)更好。王曉遲等[16]通過(guò)研究不同初始接種密度對(duì)Sf-9細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，得出104個(gè)/mL數(shù)量級(jí)是其生長(zhǎng)的臨界接種密度。本研究以104個(gè)/mL接種劑量下接種細(xì)胞，細(xì)胞倍速遞增，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。繪制Sf-9細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定細(xì)胞的對(duì)數(shù)期，為后續(xù)病毒復(fù)制條件優(yōu)化的研究提供大量對(duì)數(shù)期供試細(xì)胞。

大量高滴度病毒的制備是探索重組蛋白最佳表達(dá)條件的前提，因此進(jìn)行病毒復(fù)制條件的優(yōu)化至關(guān)重要。張佑紅等[21]在搖瓶中利用正交試驗(yàn)探討了MOI、感染時(shí)間(TOI)、細(xì)胞初始濃度(ICD)的相互關(guān)系以及對(duì)病毒產(chǎn)量的影響，得出MOI對(duì)病毒產(chǎn)量的影響最大，ICD次之，TOI影響最小。本研究以不同MOI感染Sf-9細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)以0.05個(gè)MOI感染72 h的條件下病毒產(chǎn)量最大。推測(cè)低MOI感染時(shí)，少量細(xì)胞被感染，大部分細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞自溶后釋放出病毒再次吸附感染細(xì)胞，但此時(shí)正常生長(zhǎng)的細(xì)胞與被釋放的病毒再次吸附感染的細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性消耗培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以不利于病毒的再次擴(kuò)增；高M(jìn)OI感染時(shí)，大量病毒導(dǎo)致細(xì)胞增殖到合適密度并用掉所有營(yíng)養(yǎng)資源之前就被殺死，所以病毒的擴(kuò)增產(chǎn)量也很低。

為了獲得大量的重組蛋白，本研究以不同的MOI感染Sf-9細(xì)胞來(lái)研究重組蛋白L2S最佳表達(dá)條件。曹軼梅等[22]用10個(gè)MOI重組病毒Bac mP12A3C感染Sf-9細(xì)胞，在24、48、72、96、120 h收集蛋白質(zhì)，后用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)目的蛋白,發(fā)現(xiàn)重組病毒感染48 h時(shí)就能檢測(cè)出目的蛋白，而目的蛋白的最佳表達(dá)條件是10個(gè)MOI，感染96 h。本研究發(fā)現(xiàn)，在48 h時(shí)能夠檢測(cè)到重組蛋白L2S，但是重組蛋白L2S在10個(gè)MOI，感染72 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。