蘆 鑫，高錦鴻，曹宇鋒，張麗霞，黃紀(jì)念*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

由于花生蛋白質(zhì)資源豐富、營(yíng)養(yǎng)豐富、便于加工，已經(jīng)成為世界第三大植物食用蛋白質(zhì)資源[1-3]?；ㄉ鞍踪|(zhì)雖然已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，但由于其凝膠性差，只能通過(guò)添加凝固劑(鹽、果膠)才能形成凝膠，這限制了花生蛋白質(zhì)在凝膠類食品中的應(yīng)用[4-6]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶( TGase) 是一種?；D(zhuǎn)移酶，可以催化蛋白質(zhì)中的谷氨?；唾嚢彼嵩诜肿觾?nèi)及分子間形成ε-( γ-谷氨?；? -賴氨酸共價(jià)交聯(lián)[7]，增加蛋白質(zhì)尺寸，密切蛋白質(zhì)間的聯(lián)系，提高持水能力，從而改善蛋白質(zhì)的凝膠能力[8]。前人將TGase應(yīng)用于花生蛋白質(zhì)改性已有諸多研究[9-11]，但大多以溶液黏度來(lái)評(píng)價(jià)改性反應(yīng)進(jìn)行的程度，由于TGase作用于花生蛋白質(zhì)形成大小不一的凝膠顆粒，使蛋白質(zhì)溶液呈現(xiàn)不均一的懸濁體系，測(cè)定的溶液黏度不夠準(zhǔn)確客觀且重復(fù)性差，以此評(píng)估改性反應(yīng)情況不夠合理；同時(shí)，也缺乏對(duì)TGase改性花生蛋白質(zhì)過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成變化的結(jié)果，因此，有必要引入新的變量來(lái)考察TGase改性花生蛋白質(zhì)過(guò)程并分析改性對(duì)花生蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。

在TGase改性花生蛋白質(zhì)過(guò)程中，會(huì)從溶液中析出形成漂浮于液面的凝膠顆粒，將這些凝膠顆粒定義為改性蛋白質(zhì)。以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率、持水能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析酶解時(shí)間、pH值、加酶量對(duì)TGase改性花生蛋白質(zhì)的影響，確立最佳的改性條件，并分析改性過(guò)程中花生蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞基組成的變化規(guī)律，并對(duì)比改性前后花生蛋白質(zhì)功能特性的差異，為TGase改性花生蛋白質(zhì)的后續(xù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 花生蛋白質(zhì)粉：自制，具體條件見文獻(xiàn)[12]；KBr：光譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；丙烯酰胺、N，N′-亞甲雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸：電泳純，美國(guó)Amersco公司生產(chǎn)；TGase(活性4 200 U/g)：濟(jì)南青瑞生物科技有限公司生產(chǎn)；電泳Marker(分子質(zhì)量15～170 ku)：美國(guó)賽默飛世爾科技公司有限公司生產(chǎn)；其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 電泳儀：DYCZ-24DN，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；凝膠成像儀：Gel-Doc XR+，美國(guó)伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)；質(zhì)構(gòu)儀：TMS-pro，美國(guó)FTC公司生產(chǎn)；傅里葉紅外分析儀：IS5，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)；全自動(dòng)凱氏定氮儀：K-05，上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 TGase改性花生蛋白質(zhì) 根據(jù)前期研究[9-11]，配制質(zhì)量濃度70 g/L的花生蛋白質(zhì)溶液，在45 ℃下，分別以120、140、160 U/g的加酶量加入TGase，在pH值7.7、8.0、8.3分別反應(yīng)35、45、55 min，具體見表1。反應(yīng)結(jié)束后，采用配置0.075 mm孔徑濾布的平板離心機(jī)于1 000 r/min下離心，收集濾網(wǎng)上的蛋白質(zhì)凝膠團(tuán)，稱取3 g凝聚團(tuán)測(cè)定持水能力，剩余采用冷凍干燥，獲得改性花生蛋白質(zhì)，稱質(zhì)量計(jì)算改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率。

表1 花生蛋白質(zhì)TGase改性響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平

1.2.2 花生蛋白質(zhì)持水能力測(cè)定 為了反映改性過(guò)程中花生蛋白質(zhì)形成凝聚團(tuán)結(jié)構(gòu)的均一完整程度，引入評(píng)價(jià)指標(biāo)——持水能力?？疾旆Q取0.5 g樣品，放入Amicon Ultra-4(配置截留分子質(zhì)量3 ku超濾芯)超濾離心管，稱取總質(zhì)量，4 000 r/min離心15 min,將過(guò)濾出的水倒出并擦干濾膜和離心管內(nèi)壁殘留的水珠，稱取離心后總質(zhì)量，計(jì)算持水能力[13]。

式中：WHC為持水能力，M1為樣品和離心管離心前的總質(zhì)量，M2為離心后樣品和離心管的總質(zhì)量，η為樣品中的水分含量，M為樣品的質(zhì)量。

1.2.3 改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率測(cè)定 采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010，N為5.46)測(cè)定花生蛋白質(zhì)含量(Co)與改性花生蛋白質(zhì)含量(Cf)，采用下面公式計(jì)算：

1.2.4 花生蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)分析 采用電子掃描顯微鏡分析未改性花生蛋白質(zhì)與TGase改性花生蛋白質(zhì)[14]，其中，TGase改性花生蛋白質(zhì)樣品(下同)為70 g/L花生蛋白質(zhì)溶液以加酶量144.20 U/g、pH值8.15、45 ℃反應(yīng)46 min的產(chǎn)物。

1.2.5 花生蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 參考蘆鑫等[14]的方法，獲取TGase改性花生蛋白質(zhì)樣品的紅外光譜后，用Origin 8.5以二次微分從紅外光譜1 600～1 700 cm-1的波峰中尋找隱峰，按照1 610～1 642 cm-1歸屬β-折疊、1 642～1 650 cm-1歸屬無(wú)規(guī)卷曲、1 650～1 660 cm-1歸屬α-螺旋、1 660～1 680 cm-1歸屬β-轉(zhuǎn)角、1 680～1 700 cm-1歸屬β-逆折疊[15]進(jìn)行歸類計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。

1.2.6 花生蛋白質(zhì)的變性電泳測(cè)定 分別取0.1 g樣品加入2 mL樣品處理液(0.02 g/mL SDS、0.05 g/mL β-巰基乙醇、0.001 g/mL溴酚藍(lán)、0.10 g/mL甘油、0.05 mol/L pH值為 6.8的 Tris-HCl)，100 ℃水浴加熱3 min，10 000 r/min離心10 min,取上清液，用于電泳。電泳條件：3%濃縮膠濃度、10%分離膠、取5 μL上清液上樣，濃縮膠時(shí)采用15 mA，分離膠時(shí)采用30 mA。電泳完畢后，迅速將凝膠采用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色60 min，收集染色液，隨后加入脫色液在搖床上脫色[16]。膠片在凝膠成像系統(tǒng)中拍攝并用Image Lab 5.0進(jìn)行分析。

1.2.7 蛋白質(zhì)凝膠質(zhì)構(gòu)測(cè)定 為評(píng)價(jià)改性對(duì)花生蛋白質(zhì)凝膠性的影響，以大豆蛋白質(zhì)作為對(duì)照，分別配制150 g/L的大豆與花生蛋白質(zhì)溶液，將蛋白質(zhì)溶液在90 ℃加熱40 min，隨后用冰水浴迅速將凝膠冷卻至室溫，最后將樣品放入4 ℃冰箱過(guò)夜[17-18]。二次壓縮試驗(yàn)前，在室溫下靜置1 h，測(cè)定時(shí)采用Φ50 mm圓形探頭、壓縮距離10 mm、前進(jìn)速度60 mm/min、壓縮速度60 mm/min、后退速度60 mm/min，計(jì)算硬度、黏附力、黏附性、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性。

1.2.8 蛋白質(zhì)的功能特性 為考察改性對(duì)花生蛋白質(zhì)功能特性的影響，分別測(cè)定花生蛋白質(zhì)與TGase改性花生蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性[19-20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.2進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析，以Duncan’s法進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGase改性花生蛋白質(zhì)最優(yōu)條件的確立

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)：以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率為因變量的回歸模型高度顯著(P<0.01),且失擬項(xiàng)P=0.06>0.05(表3)，表明該模型可以客觀地反映改性因素對(duì)改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率的影響規(guī)律，并且由于R2為0.992 4(調(diào)整R2為0.978 8)，因此，模型的回歸方程能夠準(zhǔn)確反映改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率的變化趨勢(shì)，以確立最佳的TGase改性條件，獲得的回歸方程如下：

表2 花生蛋白質(zhì)TGase改性響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

注：括號(hào)中數(shù)字為試驗(yàn)編碼值。

在響應(yīng)面考察的因素變化范圍中，加酶量和pH值是高度顯著因素(P<0.01)，且pH值的影響大于加酶量，酶解時(shí)間是非顯著影響因素(P>0.05)；同時(shí)，因素間的交互作用不顯著(表3)。

分析持水能力發(fā)現(xiàn)，模型高度顯著(P<0.01)，且失擬項(xiàng)P=0.10>0.05，說(shuō)明模型能夠客觀反映改性因素與改性蛋白質(zhì)持水能力的關(guān)系，其中反應(yīng)時(shí)間是第一影響因素，pH值是第二影響因素，加酶量是第三影響因素(表3)。此外，由于R2=0.985 3，調(diào)整R2=0.958 9，表明該回歸模型的回歸曲線可以預(yù)測(cè)持水能力的變化趨勢(shì)，方程回歸模型如下：

表3 TGase改性因素對(duì)改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力影響的方差分析

注：以改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率為因變量的回歸模型R2為0.992 4(調(diào)整R2為0.978 8)，以持水能力為因變量的回歸模型R2為0.985 3(調(diào)整R2為0.958 9)；*、**分別表示在0.05、0.01水平上差異顯著、極顯著。

由于酶解時(shí)間對(duì)改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率是非顯著影響因素，固定酶解時(shí)間45 min，分析加酶量與pH值對(duì)改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力的影響。由圖1a、圖1b可知，pH值7.7～8.3時(shí)，加酶量增加可以提高改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力，且當(dāng)pH值在8.0以上時(shí)，增加加酶量能更有效地促進(jìn)改性蛋白質(zhì)形成、改善持水能力(圖1c、圖1d))。增加加酶量可以提高酶分子與底物碰撞的概率，從而加速TGase改性反應(yīng)，提高改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率，且隨著加酶量的增加，也會(huì)促進(jìn)TGase催化已改性的花生蛋白質(zhì)繼續(xù)形成分子間、分子內(nèi)的共價(jià)交聯(lián)，從而使蛋白質(zhì)凝聚團(tuán)更加致密，提高持水能力。在高pH值條件下，增加加酶量能更有效地促進(jìn)酶解反應(yīng)的原因可能是，在堿性條件下，TGase的活性中心更加暴露，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，從而提高改性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。由圖1可知，獲得高改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率的試驗(yàn)條件與獲得高持水能力的試驗(yàn)條件存在差異，當(dāng)pH值為8.0～8.1時(shí)產(chǎn)生高持水能力的凝膠團(tuán)，而pH值為8.1～8.2時(shí)，改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率最高。這可能是蛋白質(zhì)凝聚方式改變引起的差異，花生蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)在4.5左右[21]，當(dāng)pH值大于pI時(shí)，花生蛋白質(zhì)帶負(fù)電，且隨pH值偏離pI程度越大，蛋白質(zhì)所帶電荷極性越強(qiáng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)帶有較強(qiáng)的同性電荷，由于排斥力作用，蛋白質(zhì)分子間凝聚速度減慢，削弱蛋白質(zhì)分子間的鏈接，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠團(tuán)緊密程度下降，從而導(dǎo)致持水能力下降[22]。

SAS分析顯示，在取值范圍內(nèi)，TGase改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率存在最大值，預(yù)測(cè)最高產(chǎn)率為(83.19±0.66)%，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件為：加酶量為144.16 U/g，pH值為8.17，反應(yīng)時(shí)間為45.96 min。由于持水能力在取值范圍內(nèi)僅存在鞍點(diǎn)，故僅以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率為優(yōu)化目標(biāo)，根據(jù)實(shí)際情況，對(duì)最佳酶解因素進(jìn)行調(diào)整如下：加酶量為144.20 U/g，pH值8.15，時(shí)間為46 min，在此條件下，產(chǎn)率為(83.17±0.38)%，持水能力為(45.63±0.24)%。

2.2 TGase改性對(duì)花生蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 微觀結(jié)構(gòu) 采用電子顯微鏡觀察未改性花生蛋白質(zhì)與改性花生蛋白質(zhì)的形態(tài)發(fā)現(xiàn)：未改性花生蛋白質(zhì)顆粒為表面凹凸不平的球體(圖2a)，而改性花生蛋白質(zhì)顆粒體積增加(圖2c)，且改性后的花生蛋白質(zhì)表面的結(jié)構(gòu)更加粗糙且凹凸不平(圖2d)。上述結(jié)果表明，TGase改性會(huì)改變蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)，這與張春紅等[23]采用TGase改性花生蛋白質(zhì)膜會(huì)改變?cè)形⒂^結(jié)構(gòu)的報(bào)道一致。

2.2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu) 由表4知，在TGase改性過(guò)程中，α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角隨改性時(shí)間延長(zhǎng)均有所下降，其中β-轉(zhuǎn)角下降程度明顯；而β-逆折疊則顯著提高，從未改性的16.25%上升到改性45 min的22.90%，經(jīng)過(guò)TGase改性后，花生蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成接近大豆蛋白質(zhì)。推測(cè)由于TGase催化產(chǎn)生新的共價(jià)聯(lián)結(jié)，導(dǎo)致形成新的空間位阻，造成花生蛋白質(zhì)的多肽鏈伸展方向與彎曲方式發(fā)生變化。另外，對(duì)比大豆蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，未變性的花生蛋白質(zhì)與其存在顯著差異。

圖1 加酶量和pH值對(duì)改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力的影響

a、b為花生蛋白質(zhì)(×500、×2 000)； c、d為TGase改性花生蛋白質(zhì)(×500、×2 000)圖2 花生蛋白質(zhì)與TGase改性花生蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)

樣品改性時(shí)間/minβ-折疊無(wú)規(guī)卷曲α-螺旋β-轉(zhuǎn)角β-逆折疊 大豆蛋白質(zhì)29.82±0.42b10.75±0.55b12.50±0.78d25.47±0.53d21.52±0.33c花生蛋白質(zhì)030.49±0.72a11.27±0.15a14.84±0.14a27.15±0.08a16.25±0.35h530.51±0.39a11.08±0.05ab14.52±0.54a26.57±0.09ab17.31±0.30g1029.81±0.25b11.23±0.16a14.45±0.59a26.30±0.30bc18.21±0.13f1529.66±0.04b11.11±0.10ab14.10±0.42ab26.35±0.37bc18.79±0.12f

續(xù)表4 大豆蛋白質(zhì)與TGase改性花生蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) %

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.2.3 亞基組成 由圖3可知，隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)，花生蛋白質(zhì)的亞基組成發(fā)生明顯變化，除了原有的花生球蛋白質(zhì)、伴花生球蛋白質(zhì)Ⅰ和Ⅱ以外，還產(chǎn)生了分子質(zhì)量大于70 ku的高分子蛋白質(zhì)，并且該蛋白質(zhì)含量也逐漸增加。高分子蛋白質(zhì)是TGase催化花生蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間形成共價(jià)交聯(lián)的產(chǎn)物。上述發(fā)現(xiàn)與前人研究TGase改性乳蛋白質(zhì)的亞基組成變化相似[24-25]。

泳道1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)； 泳道2—7分別為TGase改性0、5、15、25、35、45 min的花生蛋白質(zhì)圖3 TGase改性花生蛋白質(zhì)的變性電泳圖

2.3 TGase改性對(duì)花生蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響

由表5可知，通過(guò)經(jīng)過(guò)TGase改性后，花生蛋白質(zhì)凝膠硬度、黏附力、黏附性、膠黏性顯著提高，但內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性顯著下降，表明TGase可以部分改善花生蛋白質(zhì)的凝膠性。與大豆蛋白質(zhì)形成的凝膠相比，TGase改性花生蛋白質(zhì)形成的凝膠硬度高、彈性差、咀嚼性差，這說(shuō)明改性花生蛋白質(zhì)形成的凝膠性質(zhì)與大豆蛋白質(zhì)凝膠存在明顯差異，產(chǎn)生上述差異的原因是蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)除受蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響外，還受氫鍵、二硫鍵、疏水表面積、鹽離子、加工條件等因素影響?？梢?，TGase改性花生蛋白質(zhì)可以提高凝膠性，但形成的凝膠硬度高而彈性差，不耐咀嚼，需要采用其他方法來(lái)進(jìn)一步改善花生蛋白質(zhì)凝膠特性。

表5 TGase改性對(duì)花生蛋白質(zhì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

由表6可知，通過(guò)TGase改性的花生蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性有了明顯提高，分別較花生蛋白質(zhì)提高到1.41、1.30倍，這表明通過(guò)TGase改性使蛋白質(zhì)分子間與分子內(nèi)形成更多的共價(jià)聯(lián)結(jié)，使其形成了更加嚴(yán)密與完整的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高對(duì)水、油的包覆能力。但改性會(huì)降低花生蛋白質(zhì)乳化能力與起泡能力，這可能是TGase催化導(dǎo)致形成了高分子質(zhì)量花生蛋白質(zhì)聚合物，這類蛋白質(zhì)在溶液、界面中不穩(wěn)定，易聚集、沉淀析出，從而削弱了蛋白質(zhì)的乳化能力[26]。此外，由于高分子蛋白質(zhì)的形成會(huì)降低蛋白質(zhì)在界面重新排列的能力，從而削弱界面膜的穩(wěn)定性，造成蛋白質(zhì)起泡能力下降。上述結(jié)果與前人報(bào)道相一致[20,26]。

表6 TGase改性對(duì)花生蛋白質(zhì)功能性的影響 %

3 結(jié)論與討論

本研究以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定TGase改性花生蛋白質(zhì)的最佳工藝為：70 g/L 花生蛋白質(zhì)溶液在加酶量為144.20 U/g、pH值 8.15、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間46 min條件下,改性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率為(83.17±0.38)%。通過(guò)電子顯微鏡、紅外光譜與變性電泳分析改性對(duì)花生蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明：TGase改性會(huì)增加蛋白質(zhì)顆粒的尺寸，并增加表面的粗糙程度；同時(shí)，花生蛋白質(zhì)中β-轉(zhuǎn)角比例下降；而β-逆折疊顯著提高，經(jīng)過(guò)TGase改性后，花生蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成接近大豆蛋白質(zhì)；另外，花生蛋白質(zhì)的原有亞基無(wú)明顯變化，但有TGase催化產(chǎn)生高分子蛋白質(zhì)。上述結(jié)構(gòu)變化使改性前后的花生蛋白質(zhì)功能特性產(chǎn)生差異，改性后的花生蛋白質(zhì)凝膠特性有部分改善，其硬度、黏附性、膠黏性顯著提高，吸油性、吸水性也有大幅提高，但乳化能力與起泡能力明顯降低。

與前人研究相比，本研究以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)TGase改性蛋白質(zhì)采用黏度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)結(jié)果隨機(jī)性大的缺點(diǎn)，為客觀分析TGase改性花生蛋白質(zhì)提供了可靠途徑。同時(shí)，確定的最優(yōu)工藝也為TGase改性花生蛋白質(zhì)的工業(yè)化轉(zhuǎn)化提供了參考。本研究雖然分析TGase改性前后花生蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的變化，但并未量化花生蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化與功能特性間的關(guān)系，這方面的研究需要進(jìn)一步開展。