方芳，丁爽，吳春玲，段宏梅，劉海娜，肖衛(wèi)國

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽 110001）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是主要累及關(guān)節(jié)的自身免疫性炎癥性疾病，基本病理改變是滑膜炎［1］?；ぜ?xì)胞異常增殖引起關(guān)節(jié)骨、軟骨及軟組織結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受損、受累個(gè)體生活質(zhì)量下降，甚至致殘。除了傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥物，針對(duì)腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interlukin 6，IL-6）等的生物制劑越來越多應(yīng)用于臨床，進(jìn)而改善骨質(zhì)，延緩了關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷［2］。但由于RA疾病本身的異質(zhì)性，現(xiàn)有治療并不都能得到滿意的療效。因此，越來越多的研究試圖尋找新的治療靶點(diǎn)來干預(yù)RA的發(fā)病過程。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ bone morphogenetic protein，BMP） 屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（ transforming growth factor，TGFβ-） 超家族［3］。除了具有異位成骨能力，還參與胚胎發(fā)育，具有維持組織穩(wěn)態(tài)等多種生物學(xué)功能［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BMP-7對(duì)體外培養(yǎng)的RA 成纖維樣滑膜細(xì)胞（ fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS） 增殖具有促進(jìn)作用，現(xiàn)應(yīng)用Noggin拮抗BMP-7，阻斷BMP-7/Smad通路，觀察RA FLS增殖及炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)，為進(jìn)一步闡明BMP-7/Smad通路在RA滑膜炎癥調(diào)控中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 RA滑膜組織標(biāo)本：滑模標(biāo)本取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院關(guān)節(jié)外科住院行關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)的RA患者的膝關(guān)節(jié)滑膜，診斷符合1987年ACR修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)，其中男2例，女1例。標(biāo)本獲取均征得患者本人知情同意。

1.1.2 主要試劑：Recombinant Human Noggin、Recombinant Human BMP-7（ 美國Peprotech公司） ，EliVisionTMplus試劑盒（ 福州邁新生物技術(shù)公司） ，PMll640、高糖DMEM培養(yǎng)基、消化用胰酶（ 美國Gibco公司） ，血清（ 美國Hyclone公司） ，Cell CountingKit-8 （ 日本Dojindo公司） ，PCR引物（ IL-6 正義鏈，ACCGTCATCATG TCTGACCA；反義鏈，TGGAACACCCTGTCTTTGAC。IL-8 正 義 鏈，ACCGTCATCATGTCTGACCA；反 義鏈，TGGAACACCCTGTCTTTGAC，上海生工公司） ，RNAiso plus、RT-RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 RA FLS培養(yǎng)與鑒定：將手術(shù)室無菌獲取的滑膜組織置于含有培養(yǎng)液的無菌容器中，置于冰盒內(nèi)，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)操作。去除脂肪組織和纖維組織，用磷酸鹽緩沖液（ PBS）清洗3～5次，用眼科剪反復(fù)剪切成糊狀，于無菌培養(yǎng)皿中加入Ⅱ型膠原酶（ 1 mg/mL） ，37 ℃、消化2～4h，過濾、離心去上清，將細(xì)胞重懸于達(dá)氏修正液（ DMEM培養(yǎng)液） ，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)分裝培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，當(dāng)細(xì)胞長成梭形并成片后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。RA FLS鑒定采用波形蛋白vimentin及CD68免疫組化法。實(shí)驗(yàn)用3～7代細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將3～7代RA FLS接種到96孔板中 （1×104/孔） ，共4板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，棄培養(yǎng)液；將BMP-7 （終濃度200 ng/mL） 和Noggin （終濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8 μ g/mL） 配置到培養(yǎng)液中，每個(gè)BMP-7濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h后分別取出1個(gè)96孔板，加入20 μ L CCK8試劑，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，置搖床上低速振蕩約10 min，酶標(biāo)儀上檢測波長450 nm下每孔的吸光度值，然后根據(jù)數(shù)值做增殖曲線。

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR檢測IL-6、IL-8 mRNA：取BMP-7 （終濃度分別為0、25、50、100、200 ng/mL） 及BMP-7 （終濃度為200 ng/mL） +Noggin （終濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8 μ g/mL） 培養(yǎng)RA FLS 24 h，按照試劑盒操作說明分別測定IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)，使用ABI RQ manager軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Noggin阻斷BMP-7/Smad通路對(duì)RA FLS增殖的影響

BMP-7 （200 ng/mL） 聯(lián)合Noggin培養(yǎng)RA FLS，隨Noggin濃度增加，BMP-7促進(jìn)RA FLS增殖作用減弱。在 培 養(yǎng)48、72 h，0.4及0.8 μ g/mL Noggin對(duì)RA FLS的增殖抑制作用與對(duì)照組 （Noggin 0 μ g/mL） 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ；當(dāng)Noggin濃度為0.8 μ g/mL時(shí)，對(duì)增殖的抑制作用最強(qiáng) （P ＜ 0.05） ，見表1。

2.2 阻斷BMP-7/Smad通路對(duì)IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，BMP-7上調(diào)RA FLS炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)，且隨濃度上升呈下降趨勢 （P ＜ 0.05） ，見表2。阻斷后，當(dāng)Noggin濃度為0.8 μ g/mL時(shí)，能夠較好拮抗BMP-7 （濃度200 ng/mL） ，下調(diào)IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)，見表3。

3 討論

BMP作為重要的成骨因子，在各種類型的關(guān)節(jié)炎研究中有很多報(bào)道［5］。關(guān)于BMP-7與軟骨細(xì)胞代謝研究［6］發(fā)現(xiàn)，BMP-7通過刺激細(xì)胞外蛋白及受體、調(diào)節(jié)生長因子，同分解代謝有關(guān)的細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝。在關(guān)于RA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［7］也發(fā)現(xiàn)有BMP/Smad通路活化。同TGF-β相似，BMP信號(hào)通路通過跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體 （Ⅰ型、Ⅱ型BMP受體） 發(fā)揮作用。BMP二聚體配體與BMPⅠ或Ⅱ型受體結(jié)合，顯著活化下游信號(hào)，參與Smad家族成員分子或絲裂原活化蛋白激酶活化過程［8］。

表1 不同濃度Noggin阻斷BMP-7/Smad通路對(duì)RA FLS增殖的影響Tab.1 Effect of blocking BMP-7/Smad pathway with different concentrations of Noggin on the proliferation of RA FLS

表2 BMP-7 對(duì)RA FLS炎性細(xì)胞因子IL-6 、IL-8 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of BMP-7 on the expression of IL-6 and IL-8 mRNA in RA FLS

表3 不同濃度Noggin對(duì)BMP-7誘導(dǎo)IL-6 、IL-8 mRNA表達(dá)的影響Tab.3 Effect of different concentrations of Noggin on the expression of IL-6 and IL-8 mRNA induced by BMP-7

BMP信號(hào)通路通過配體多樣性、細(xì)胞外BMP拮抗劑分泌、I-Smads以及核協(xié)阻遏物和共活化物等在不同水平被調(diào)節(jié)［9-10］。BMP拮抗劑包括Noggin、Chordin、Follistatin、Dan/Cerberus家 族、Gremlin、Dante、Sclerostin和Chordin樣 蛋 白［11］。其 中Noggin是典型的BMP拮抗劑，可阻滯BMP與其相應(yīng)的受體結(jié)合，抑制其信號(hào)傳導(dǎo)通路。在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎 （collagen-induced arthritis，CIA） 鼠關(guān)節(jié)滑膜中，Noggin表達(dá)在0～20 d穩(wěn)定在一定水平，在20 d后逐漸下降［12］。除了關(guān)節(jié)疾病，在其他多種疾病［肥胖癥、糖尿病、進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良 （fibrodysplasia ossification progressive，F(xiàn)OP） 、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH） 、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥 （hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT） 、腫瘤］中同樣存在著BMP信號(hào)通路異常。上述疾病研究發(fā)現(xiàn)，BMP/Smad通路在維持血管穩(wěn)定性中發(fā)揮作用，并且信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)高度依賴于其內(nèi)分泌及循環(huán)特性。但關(guān)于BMP及其受體，以及信號(hào)通路在關(guān)節(jié)炎性疾病以及上述疾病中的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。

前期研究［13］發(fā)現(xiàn)RA患者血清中BMP-7水平升高，同疾病活動(dòng)相關(guān)，并且體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BMP-7在關(guān)節(jié)炎癥部位高表達(dá)，促進(jìn)RA FLS增殖。為了進(jìn)一步研究BMP-7/Smad信號(hào)通路是否參與RA FLS增殖過程，選擇Noggin作為BMP-7/Smad通路阻斷劑，進(jìn)行信號(hào)通路阻斷的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP-7對(duì)RA FLS增殖促進(jìn)作用減弱，并且RA FLS表達(dá)炎性細(xì)胞因子水平降低，提示其發(fā)揮作用可能是通過阻斷BMP-7/Smad信號(hào)通路。故推測BMP-7可能是通過Smad依賴性通路，促進(jìn)關(guān)節(jié)修復(fù)，但其表達(dá)增多可能對(duì)關(guān)節(jié)炎癥有促進(jìn)作用，拮抗其表達(dá)有助于炎癥狀態(tài)的控制。

BMP-7對(duì)炎性細(xì)胞因子雖然有促進(jìn)作用，但同前期研究相比 （TNP-α促進(jìn)RA FLS炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生） ，炎性細(xì)胞因子整體表達(dá)水平偏低，說明其促炎作用是有限的。實(shí)驗(yàn)僅研究了體外培養(yǎng)的RA FLS，BMP-7對(duì)RA滑膜中的其他細(xì)胞有怎樣的影響尚不明確，有待進(jìn)一步研究確證。Noggin作為BMP-7拮抗劑，在一定濃度下有可能拮抗BMP-7對(duì)關(guān)節(jié)的破壞作用。雖然目前研究尚不足以證實(shí)單純BMP信號(hào)通路異?？烧T發(fā)RA疾病病理過程，但BMP-7或是其他拮抗劑有可能在關(guān)節(jié)炎癥過程中動(dòng)態(tài)變化［14］，并通過Smad通路在RA滑膜炎癥調(diào)控中發(fā)揮作用。靶向BMP-7/Smad信號(hào)通路分子能否成為改善RA患者關(guān)節(jié)炎癥的治療手段，尚需要進(jìn)一步精確的信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。